大豆根腐病的发生与防治

大豆根腐病的发生与防治

大豆根腐病是大豆土地常见的生长根部疾病。由于其发生在后期，它对大豆的生长有很大的影响。随着人们对环境保护和绿色农业的重视,生物防治已逐渐成为人们研究和开发的热点。用于植物土传根腐类病害的生防菌很多,如木霉菌(Trichoderma)、毛壳菌(Chaetomium)、青霉菌(Penicilliun)、小盾壳霉(Conithyriumminitans)粘帚霉属(Gliododium)、木霉属(Trichoderma)、链霉属(Streptomycesspp)、无致病力尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、土壤杆菌属(Agrobacteriumspp.)、假单孢杆菌属(Pseudomonasspp.)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、产碱菌属(Alcaligenesspp.)、链霉菌属(Streptomycesspp.)等,目前也有一些制剂问世,但生产中应用的多为单一菌。大豆根腐病是由多种镰孢菌(Fusariumspp.)、多种腐霉菌(Pythiumspp.)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)等引起。对于多种致病菌复合侵染的根腐病,单一菌株适应性差、环境依赖性强、需菌量大且防治效果偏低。研究表明,任何单一的生防制剂都不能很好地控制大豆根腐病,大豆根腐病病原菌具有较高的变异性,制剂抗性不可能持续。为了探讨多种生防菌对大豆根腐病菌控制的有效性和可行性,开展了多菌复配、组合等方面研究,以期为大豆根腐病生防制剂的研究和应用提供理论依据。1材料和方法1.1微生物及微生物b7、毛壳菌病原菌:尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)。生防菌:木霉菌株FMM9、FMM35、FMM5、细菌B7、毛壳菌(Chaetomiumspp.)CHZ1。均由中国科学院东北地理与农业生态研究所作物生理生态实验室保存。1.2试验培养基NA培养基、PDA培养基、麦麸培养基和高粱粒培养基。1.3菌种培养1PDA上活化生防真菌培养3d,从其正在生长菌落边缘打取(5mm直径)菌饼5个,放入麦麸培养基培养10d(25℃暗培养);同样方法活化尖孢镰刀菌、立枯丝核菌放入高粱粒培养基10d,培养好的菌剂4℃保存。1.4内部测量生防真菌生长速度及产孢量测定:平皿生长法;孢子萌发试验:玻片法(Mandels盐培养液中萌发)。生防菌体外拮抗试验:平皿对峙法。1.5大豆种子及其产物的添加量和接种方法供试复配组合:共设10个复配组合,分别为FMM9和FMM35;FMM9和B7;FMM9和CHZ1;FMM35和B7;B7和CHZ1;FMM35和CHZ1;FMM9、FMM35和B7;FMM9、FMM35和CHZ1;FMM35、B7和CHZ1;FMM9、B7和CHZ1。复配菌剂(含载体)、尖孢镰孢菌剂(含载体)和高温灭菌土按3.5∶14∶350比例;复配菌剂(含载体)、尖孢镰刀菌剂(含载体)和高温灭菌土按3.5∶10.5∶350比例分别在塑料袋中充分混匀倒入小钵(12cm×10cm)中,播入大豆种子(合丰25,已消毒)8粒。对照分别只接尖孢镰刀菌、同时施40%多菌灵可湿性粉剂和大豆根腐病菌、未接任何病菌。处理、对照设6次重复。一个月后调查大豆根腐病发病级别,计算病情指数,同时调查大豆全株鲜重和全株干重,试验重复3次,数据用SAS进行方差分析。2结果与分析2.1真菌生长速度的差异菌落生长速度决定着生防菌在土壤中空间竞争能力的强弱,不同真菌生长速度不同。将FMM5、FMM9、FMM35和CHZ1接种在PDA平板中央,待菌落出现时,每天测量菌落半径直至长满平皿。调查结果显示,不同生防真菌生长速度存在差异,其中FMM5菌落生长速度最快,3d可长满平皿,FMM35为5d,FMM9和CHZ1为7d长满平皿(图1)。通过对不同时间内真菌菌落半径的测量可知(图2),FMM5菌落生长速度最快为1.77cm·d-1,显著高于FMM9、FMM35和CHZ1;毛壳菌CHZ1生长速度最慢为0.66cm·d-1,与FMM9差异不显著,而显著低于M35。真菌生长速度的快慢会影响生防菌株的复配,生长速度过快的菌株由于竞争能力强,有可能抑制其它复配菌株的生长,不利于复配;生长速度慢的菌株也有可能被其它复配菌株和土壤中的优势菌抑制,生防效果差。生长速度相近的菌株可以共同生长,协同发挥各自的生防作用,拮抗多种病原菌的生长,便于复配。2.2不同菌株生芽孢杆菌产孢能力比较生防真菌分生孢子是制剂生产的主要繁殖体,分生孢子的产量即为选择优良生防菌的重要条件。测定结果发现,不同真菌产孢类型不同,产孢量也存在差异。木霉菌产生分生孢子,对其产孢量测定结果表明(表1),FMM5产孢能力最强,为5.4×109个·mL-1,显著高于其它木霉菌株,FMM9与FMM35产孢量差异不显著。毛壳菌产孢能力最弱为4.7×106个·mL-1,但由于毛壳菌CHZ1产生的厚垣孢子抗逆性强,即耐干燥、耐低温能力强,并且厚垣孢子对土壤抑菌作用不敏感、存活时间长,具有很强的开发潜力。木霉菌竞争优势在于菌丝生长速度快,可迅速占领空间,产孢量大,易于扩大生存空间,可见木霉菌是土传病害生物防治的理想真菌。2.3培养1h后生防菌萌发情况分生孢子萌发是生防菌拮抗病原菌防治病害发生的首要条件,生防菌施入土壤中孢子萌发的速度及孢子萌发率都可影响其在土壤中的定殖能力。试验结果表明:在培养1h后就有大量孢子萌发,其中FMM5萌发率最高可达68.20%,FMM9和CHZ1萌发率也在60%左右,FMM35低一些(图3)。萌发速度快可使其具有很强的营养和空间竞争能力,萌发率高可以使大量的孢子萌发产生菌丝进入营养生长阶段,抑制病原菌生长,提高防治效果。但在菌株复配时萌发速度快、萌发率高也可能会抑制其它生防菌的生长。分生孢子萌发过程见图5。2.4细菌生长和抗菌药力生防菌复配研究中,要测试不同菌株之间是否存在拮抗作用,从而决定其复配的可能性。菌株间拮抗作用测定结果表明(表2),FMM5对其它菌株都有不同程度的抑制作用,FMM5生长速度过快,60h两菌落交接,出现明显的抑菌圈。同时可以观察到在交界处另一菌株菌落生长速度缓慢,菌落形状变的不规则,菌丝缢缩,菌落背面颜色变黄,李雪玲等也报道出现过此现象。FMM5由于空间竞争能力很强,在菌种复配中受到限制。其它菌株由于生长速度接近,菌落在平皿中央交接,由于空间和营养的竞争,菌落停止生长,因此它们之间的抑制作用相对较弱。通过细菌和生防真菌间的拮抗试验可知,细菌B7对生防真菌FMM9、FMM35和CHZ1均具有一定的拮抗作用,细菌产生的抑菌蛋白在离体的条件下已经证明具有抗真菌的活性。因此细菌不但拮抗病原菌的生长,同时也拮抗生防菌的生长。FMM5和B7对其它生防菌均有一定的拮抗作用,FMM9、FMM35和CHZ1之间拮抗作用不明显,可以进行复配,但由于平板试验存在局限性,需通过盆栽和大田试验来验证其结果,以便筛选优势的复配生防菌组合。2.5复配菌剂对尖孢镰菌菌体的防效将FMM9、FMM35、B7和CHZ1共设10个复配组合。在盆栽试验中利用不同复配组合的生防菌剂来防治尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病。其中组合C1对尖孢镰刀菌引起根腐病的防效与多菌灵对照防效相当,为52.02%(表3),二者差异不显著。但大豆促生作用明显,植株干重、株鲜重、根干重显著高于40%多菌灵可湿性粉剂浇灌(表4)。由于根腐病是由多种病原菌复合侵染,且田间土壤微生物具有复杂的相互作用,因此复配菌剂的田间应用效果还需验证,本研究田间应用结果组合C1效果也较好,对大豆根腐病防效45.26%(结果另文发表)。因此综合分析C1菌剂复配效果较好,可进一步研究。3环境因子对生防菌生长和复配的影响将多种生防菌复配,发挥各自的优势和协同作用,可以降低根腐病的发病率,增强防治效果。木霉菌竞争优势在于产孢量大、易于扩大生存空间;毛壳菌是控制许多植物疾病的很重要的生物防治菌,它的竞争优势在于气生菌丝生长速度快;生防细菌不仅在其生长发育过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物,通过直接或间接作用,达到阻碍或杀死病原菌的效果。但生防菌在复配时由于具有不同的生理特性,其生长速度、产孢量、孢子萌发率存在差异,且不同的生防菌间可能存在拮抗作用,在试验中由于环境因子的变化,影响生防菌的生存状态,使复配受到限制,需进一步研究。生防因子应用防治效果一般不稳定,可能是因为环境因子如温度、湿度、光照等都在不断的变化,况且其它营养元素也可以影响菌株的生存状态和拮抗物质的分泌。温室盆栽相对于大田环境,生防菌和病原菌都较容易控制,但也存在一定的试验误差,因此最终要通过田间试验验证复配的效果。4复配菌株chz1的鉴定通过对生防菌生长