甜瓜枯萎病防治药剂筛选试验

甜瓜枯萎病防治药剂筛选试验

据联合国粮农组织统计，南瓜总量是所有水果的第十名，增长是所有水果的第二位。中国的甜美产量在所有国家是第一位。然而，由于干旱，祖母采取了许多措施来提高杏仁产量。而目前防治甜瓜枯萎病的主要方法还是化学防治,由于长期用药,使甜瓜枯萎病病原菌产生抗药性,最终导致防治效果不理想,再加上化学药剂的大量使用对甜瓜质量安全与环境造成许多负面影响,因此寻求绿色无公害的生物防治是甜瓜产业发展过程中的一项重要课题。自1998年哈密瓜在海南试种以来,哈密瓜在海南的种植面积不断扩大,2008年哈密瓜种植面积就已经达到了0.37万hm2。同年在海南三亚发现了甜瓜枯萎病,并最终确定是由甜瓜枯萎病病菌引起,但海南至今还没有关于甜瓜枯萎病生防菌的报道。本研究通过从海南土壤中筛选拮抗菌防治甜瓜枯萎病,以期为热带地区甜瓜枯萎病的生物防治提供科学依据,同时丰富甜瓜枯萎病的生防资源,促进生物防治技术的发展。1材料和方法1.1土壤样品采集甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9062(Fusariumoxysporum),来源于福建省农业科学院农业生物资源研究所农业微生物研究中心;甜瓜种子南海蜜,由新疆宝丰种业有限公司和三亚市南繁科学技术研究院联合选育;土壤样品采集于海南省三亚、陵水、保亭、乐东、五指山、儋州、白沙、临高、澄迈、文昌、琼海等11市县;参照《微生物实验手册》配制PDA、PDB、改良马丁培养基、高氏一号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。1.2测试方法1.2.1菌种的活化处理称取10.0g土壤样品于装有90.0mL灭菌水和几粒沸石的250mL锥形瓶中,将锥形瓶放于振荡器上,以200r/min振荡30min;然后按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍系列稀释后,分别吸取100μL菌悬液均匀涂布于不同培养基的分离平板上,每个处理3次重复。将涂布好的平板置于28℃下恒温培养,待菌落长出后,对其进行多次划线分离纯化培养,直至得到纯菌株。1.2.3培养抗菌剂(1)平板对峙实验(同步拮抗实验):以甜瓜枯萎病菌为指示菌,将初筛得到产生抑菌带的菌株,用打孔器打取5mm菌饼接种于距离病原菌中心2cm的四周,同一平板上只接一种初筛菌;培养4d后测抑菌圈半径、拮抗菌半径,计算拮抗指数。抑菌圈半径=拮抗菌菌饼中心至甜瓜枯萎病病菌菌丝边缘的距离拮抗指数=(抑菌圈半径-拮抗菌半径)/拮抗菌半径(2)继代培养实验:将平板对峙实验中筛选的拮抗效果较好的菌种进行继代培养,逐代进行平板对峙实验,观测其拮抗指数的变化,从而确定菌种的遗传稳定性。(3)发芽率实验:将平板对峙实验中筛选的拮抗指数较好的菌株转接至PDB培养基中摇床振荡培养24h,即得拮抗菌菌悬液;挑取饱满的南海蜜甜瓜种子,用10%H2O2对甜瓜种子进行表面消毒5min后用无菌水清洗3～4次,再将种子浸泡于拮抗菌菌悬液中2h,同时以未加入拮抗菌的PDB作对照,每处理30粒甜瓜种子,3次重复;浸泡完毕后,将甜瓜种子置于灭菌培养皿中的湿润无菌滤纸上,种子上加盖一层湿纱布,30℃催芽36h,统计种子的发芽率。1.2.4甜瓜枯涣病的防治将甜瓜枯萎病病原菌摇床培养之后,制成107CFU/mL的孢子悬浮液,拮抗菌选择拮抗效果较好的菌株D1、F1、H3做盆栽实验,分别将拮抗菌培养好后,制成106、107、108CFU/mL3个浓度的菌悬液,在甜瓜苗缓苗后进行接菌处理。所做的处理有先接病原菌,再接不同浓度的上述拮抗菌(以D1为例,拮抗菌液由低至高浓度,分别记为D1-1、D1-2、D1-3)和先分别接不同浓度的拮抗菌,再接入病原菌(分别记为D1-4、D1-5、D1-6),以只接入病原菌为对照,每种菌的接菌量均为10mL,每个重复10盆,每盆1株甜瓜苗。接菌之后每天观察植株发病情况,计算病情指数和相对防治效果。甜瓜枯萎病发病分级标准:0级,全株无病;1级,植株1/4以下叶面表现萎蔫症状;2级,植株1/4～1/2叶面表现萎蔫症状;3级,植株1/2以上叶面表现萎蔫症状;4级,全株萎蔫死亡。1.2.5微生物的测定参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》及《分子克隆实验指南》的方法对拮抗菌F1的菌体形态、生理生化指标进行测定及16SrDNA测序。2结果与分析2.1对菌株的分离和提取从所采集的土壤样品中分离纯化得到570株菌。2.2抗感染的初始筛选通过对分离纯化的菌株进行平板对峙实验,筛选到43株对甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9062有抑制效果的菌株。2.3抗感染复过滤2.3.1抗性能测定各越好的比较拮抗指数作为拮抗菌对病原菌拮抗效果的一种表示方式,当拮抗指数越大时,拮抗菌对病原菌的拮抗效果也就越好;反之,则拮抗效果越差。将初筛中得到的43株菌复筛,由表1可知,拮抗指数>2的菌株有9株,拮抗指数>1的菌株有11株;拮抗指数>0.5的菌株共12株,拮抗效果由好到差依次为D3、H5、H3、D1、H6、H20、F1、H7、H2、H18、H19、H21。2.3.2株病原菌fat-9062的抗性特征对2.3.1中拮抗指数>0.5的12株菌通过继代培养,观察其子代对病原菌FJAT-9062的拮抗效果。由图1可知,在第20代时只有5株菌对病原菌FJAT-9062还有拮抗效果,它们分别是D1、F1、H3、H5、H6。说明菌株D1、F1、H3、H5、H6对病原菌FJAT-9062的拮抗效果持久有效,有利于拮抗菌在较长时间内对病原菌起到抑制作用。2.3.3不同菌株对甜瓜种子发芽率的影响对2.3.1中拮抗指数>0.5的12株菌进行甜瓜种子发芽率实验,结果见图2。菌株处理D1、F1、H3、CK之间差异不显著,发芽率分别为86.7%、92.2%、94.4%、90.0%,其他菌株处理的甜瓜种子发芽率极显著低于CK;说明D1、F1、H3菌株对甜瓜种子发芽率无不良影响。综合平板对峙、继代培养、发芽率3个实验的结果,可知拮抗菌D1、F1、H3在对病原菌拮抗效果、遗传稳定性及对甜瓜种子发芽率上比其他拮抗菌好,因此选择拮抗菌D1、F1、H3作为盆栽试验菌。2.4接种病原菌对甜瓜病情指数的影响由图3可知,只加病原菌FJAT-9062的处理,甜瓜植株的病情指数为85.0,发病最严重,F1-6处理的甜瓜植株病情指数为25.0,病情指数最低发病最轻;在其他条件相同下,经F1菌株处理的甜瓜病情指数明显小于D1、H3处理;病情指数D1-4<D1-1、D1-5<D1-2、D1-6<D1-3、F1-4<F1-1、F1-5<F1-2、F1-6<F1-3、H3-4<H3-1、H3-5<H3-2、H3-6<H3-3,说明先接拮抗菌后接病原菌处理的甜瓜病情指数要小于先接病原菌后接拮抗菌,进一步说明在一定程度上拮抗菌对甜瓜枯萎病的发生有一定的预防作用;病情指数D1-3<D1-2<D1-1、D1-6<D1-5<D1-4、F1-3=F1-2<F1-1、F1-6<F1-5<F1-4、H3-3<H3-2<H3-1、H3-6=H3-5<H3-4,说明高浓度拮抗菌处理的病情指数一般要小于低浓度处理;在整体效果上,经F1菌株处理的甜瓜病情指数要明显小于D1、H3、FJAT-9062的菌株处理。由于防治效果与病情指数存在负相关的关系,即病情指数越大防治效果越差,病情指数越小防治效果越好。由图4可知,在整体效果上,F1菌株对甜瓜枯萎病的防治效果要明显大于D1、H3菌株,且F1-6处理对甜瓜枯萎病防效最好,其防效达到了70.6%。2.5srdna序列比对形态观察表明,F1菌落呈奶酪色、表面光滑、边缘规则,在液体培养基中呈沉淀性混浊,菌体杆状,芽孢中生、椭圆形。根据以上的形态特征及表2的生理生化特征实验结果,查《伯杰细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》可知,菌株F1与Bacillusmethylotrophicus最相似。将菌株F1的16SrDNA序列在NBCI中进行比对,结果表明,菌株F1与BacillusmethylotrophicusCBMB205T(EU194897)的同源性达99.8%,从图5也可以看出,菌株F1与BacillusmethylotrophicusCBMB205T(EU194897)亲缘关系最近。综合以上结果,菌株F1属于Bacillusmethylotro-phicus。3不同菌株对甜瓜枯已病的抗治效果海南地处热带,属热带季风气候,被誉为“天然大温室”,拥有丰富的微生物资源,这为拮抗菌的筛选提供了巨大空间。本研究从海南11个县市甜瓜地、蔬菜地中分离纯化到570株菌,经过初筛筛选到43株对病原菌具有拮抗作用的菌株。综合复筛的平板对峙、遗传稳定性、发芽率3个实验的结果,选择了具有抑制作用、遗传稳定性良好和对种子发芽无抑制作用的拮抗菌株D1、F1、H3作为进一步盆栽试验菌株,其结果显示了F1菌株的F1-6处理表现了良好的生防效果,对甜瓜枯萎病的防治效果达到70.6%。自Baker等于1965年于伯克利提出生物防治土传病害以来,关于利用生防菌防治甜瓜枯萎病的报道屡见不鲜。有文献报道可作为甜瓜枯萎病病原拮抗菌的有木霉菌、芽孢杆菌、非致病性尖孢镰刀菌、放线菌等。在国内防治效果试验报道中,利用木霉菌T23、Ta22经复合处理之后对甜瓜枯萎病田间防效可达到79.00%;周婧等从黄瓜、南瓜、甜瓜的根茎部筛选到具有潜在生防价值的H-5,其温室防效达到75.6%;王瑞菊等从土壤中筛选到4株对甜瓜枯萎病具有稳定拮抗作用的芽孢杆菌,室内防效最好可达到75.32%。本试验得出的室内防治效果达到70.6%,与上述报道的防治效果相差不大。进一步对F1菌株进行鉴定,确定该菌株为Bacillusmethylotrophicus(甲基营养型芽孢杆菌)。Bacillusmethylotrophicus不仅在解磷、降解纤维素方面有相关报道,而且有大量报道显示其有抗病功能;单宏英从陈化烟叶表面筛选到BC79(Bacillusmethylotrophicus菌株,发现BC79对烟草灰霉病菌、烟草炭疽病菌、烟草霜霉病菌、烟草立枯病菌、烟草赤星病菌等5种病菌都有抑制效果。冯云利等从烤烟品种NC297内生细菌中筛选到对烟草黑胫病有拮抗作用的菌株165株,其中67菌属Bacillusmethylotrophicus。菌株An-ctc-y-1(Bacillusmethylotrophicus)的抑菌谱较广,对稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、梨黑星病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌的抑制效果达到90%以上。R2-2(Bacillusmethylotrophicus)对水稻条斑病菌和水稻白叶枯病菌有较强的抑菌效果,抑菌圈直径分别为7.03、6.83cm。本试验中筛选到菌株F1在抗甜瓜枯萎病上表现出良好的防治效果,在一定程度上丰富了Bacillusmethylotrophicus的抗病谱。本试验在平板对峙实验中采用拮抗指数来评价拮抗效果,这有别于大多数文献采用抑菌率、抑菌圈的评价方法。这是由于不同微生物的在同一生长条件下,其生长速度不一样,从而造成菌落大小不一,产生拮抗物质的能力也不同,如果仅以抑菌率