药用植物黄柏木霉对大豆菌核病菌的抑菌能力研究

药用植物黄柏木霉对大豆菌核病菌的抑菌能力研究

土壤传播疾病可能导致巨大的经济损失，这通常被认为是植物领域最难治愈的疾病之一。在防治方面,化学防治和抗病品种只对少数土传病害有效,对大多数病害防效甚微,且使用化学农药还会造成农药残留,环境污染;同时化学农药的长期使用,使得病原菌对其产生抗药性,因而导致防效下降甚至失败。鉴于生物防治能扬长避短,可对大豆进行保护,对环境无污染,为绿色食品生产提供保障。而在对生防菌株木霉的利用上,大多的研究主要将精力放在哈茨木霉上,且以活体菌剂为主,生物活体制剂对环境条件要求较高,还可能对非靶生物带来潜在的影响,故笔者利用在实验中分离到的具有生防潜力与应用价值的黄绿木霉,对其代谢产物抑制菌核病核盘菌的能力进行了详细的研究,利用代谢产物抑菌,可减轻对环境的依赖与对非靶生物的危害,具有广阔的应用前景与价值,对土壤环境的质量改善具有重要意义,现将黄绿木霉代谢产物对大豆菌核病核盘菌的研究结果总结如下。1材料和方法1.1．黄油木霉菌培养法黄绿木霉(Trichodermaaureoviride),分离自密山地区土壤。大豆菌核病菌(S.sclerotiorum),黑龙江八一农垦大学植物科技学院保存。黄绿木霉菌在PDA固体培养基上培养5d,产生大量孢子,制成孢悬液浓度为107个/mL后备用;分别将黄绿木霉菌与菌核病菌培养在直径为100mm的含15mLPDA的培养皿上培养3d后,在生长能力一致的同心圆处打直径为4mm的菌片备用。1.2方法1.2.1扫描电镜观察制备PDA培养基,将生长好的黄绿木霉与菌核病菌分别在培养基同一半径周缘用打孔器取生长一致的直径为4mm的菌丝块,接种于无菌PDA平板(直径100mm)中,两接种点相距33mm,在25℃下恒温培养,接种后观察病原菌的菌落被覆盖情况,并在两菌落接触时,制作扫描电镜样品,在扫描电镜下观察菌核菌菌丝状态。1.2.2菌落直径测定黄绿木霉发酵代谢产物,用PD液体培养基将其配成50%浓度后,在直径为100mm的培养皿中央接入生长一致的4mm的丝核菌菌片,放置于26℃恒温培养,逐天记录菌落直径变化,每处理三次重复。黄绿木霉菌代谢产物的获得:配制PD培养液,分装于500mL的三角瓶中,每瓶装液量为200mL,高压湿热灭菌,冷却每瓶接入孢子量为107个/mL的黄绿木霉菌孢子悬液5mL,另一瓶作对照不接菌,置于27℃摇床中170rpm震荡培养,培养4d后,用滤纸过滤,滤液分别经高压湿热灭菌和细菌滤器过滤,得到黄绿木霉的两种培养液。1.2.3糖、麦芽糖、糖、汁、微质、培养基本培养基为马铃薯,改变马铃薯中的碳源,碳源为:葡萄糖、果糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、微晶纤维素、几丁质处理,黄绿木霉培养3d,4d分别取出,处理发酵液与病原菌接菌、培养等同1.2.2。1.2.4不同菌株对丝核菌生长的影响利用PD液体培养基,在装液量为200mL的500mL三角瓶中,接入等量的黄绿木霉菌孢子悬液后,置于27℃摇床中170rpm震荡培养1d,2d,3d,4d,5d,6d,8d,10d后分别用滤纸过滤并于121℃下灭菌25min,然后以稀释1倍,2倍,3倍,4倍,5倍,7倍,9倍,11倍的量与溶融的PDA混合,待冷却后倒皿,在直径为100mm的培养皿中央接入生长一致的4mm的丝核菌菌片,放置于26℃恒温培养,逐天记录菌落直径变化,每处理三次重复,并计算抑菌率。抑菌率=(对照菌落生长速度-处理菌落生长速度)/对照菌落生长速度×100%1.2.5不同因素对丝核菌呼吸强度的影响a.对电导率变化的影响:在直径为100mm的无菌培养皿中加入20mLPD培养液,接入一片准备好的丝核菌菌片,放置于26℃恒温培养5d,将培养好的丝核菌片用无菌水冲洗数次,用如1.2.1方法所获得的发酵液分别处理4h,6h,8h,12h,24h后,利用电导率仪测定电导率的变化,以无菌水处理为对照。b.对呼吸强度变化的影响:丝核菌菌片处理方法如a,利用发酵液分别处理2h,4h,6h,8h,12h,24h后,用溶氧仪测定呼吸强度变化。c.显微观察:将用发酵液处理24h的菌丝置于显微镜下观察。1.2.6大豆苗大豆茎部感染观察将在PD液体中培养5d的处于外围同心圆位置的菌核菌菌片用刀片切成长为5mm,宽为2mm的菌条,分成两组,一组用发酵液浸泡10min,另一组用PD浸泡10min后待用。取生长一致的大豆苗100株,用接种针将大豆茎部造成微小的条形伤口,然后分别将以上两组菌片贴于伤口处,用塑料薄膜保湿,观察大豆茎部发病情况并记录发病率。发病率=(对照发病株数-处理发病株数)/对照发病株数×100%2结果与分析2.1菌核菌的菌落发生黄绿木霉菌与菌核菌对峙培养后,菌核菌菌落随着对峙时间延长而逐渐回缩,平均5~7d菌核菌的菌落即可完全被黄绿木霉菌菌丝所覆盖,对峙接触面的扫描电镜观察到菌核菌菌丝发生变化(图1)。2.2菌落生长速度黄绿木霉代谢产物经高压灭菌与过滤除菌后,在50%浓度下,抑菌率均可达100%,即对照菌的菌落生长速度为40mm/d,而添加代谢物的均不生长。这就表明,代谢产物对丝核菌具有抑菌能力,而且该代谢物可以经受高温高压的变化,在121℃处理25min后,活性仍不丧失。2.3马铃薯的添加量利用不同碳源发现,在马铃薯培养基中添加大分子的碳源如微晶纤维素与几丁质并不能提高其对菌核菌的抑菌能力,相反却出现抑制效果,这与有些文章的结论不相符合,可能是因为代谢过程发生变化所致(表1),马铃薯添加易于利用的碳源作为发酵基质发酵黄绿木霉,即可产生对菌核病丝核菌具抑菌能力的代谢物质。2.4发酵液抑菌能力下降不同发酵天数,抑菌中浓度变化较大,发酵以3d,4d为佳,刚刚发酵前两天,抑菌作用存在,但抑菌能力较弱,抑菌中浓度大,发酵天数增多,抑菌中浓度也下降,这可能与菌体生长有关,最初以菌丝生长为主,代谢物积累较少,营养主要用来繁殖菌体,后期菌丝生长量大,发酵基质的营养消耗多,随着菌丝的进一步生长,基质消耗殆尽,代谢物中的一部分能源物质可能被用来作为替代营养而被菌丝利用,造成发酵液抑菌能力的下降(表2)。2.5呼吸强度的变化丝核菌经黄绿木霉发酵液处理后,初期电导率明显增强,但由于发酵液处理时间长菌丝破坏严重,后其电导率几乎没有变化;呼吸强度的变化却是先增强后下降,20h后几乎降低为零(图2,3)。这都与菌丝体被破坏有关,随着发酵液处理时间增加,菌丝体的完整性丧失,菌丝变粘稠,电解物质渗入到黄绿木霉发酵液中,电导率与呼吸强度均表现下降的变化。2.6显微显微观察在光学显微镜和电子显微镜下均可以看到丝核菌的菌丝形态上有变化,在光学显微镜下,未经处理的菌丝饱满,细胞壁光滑,但经处理24h后,细胞变形,似乎由立体的变为扁平的,而且在细胞的表面上还存有很多碎片,透射显微镜下观察到菌丝细胞壁有的出现空洞有的变成一白色的外周(图4,5)。2.7发病不致大豆茎体凹陷经发酵液处理的菌丝体侵染能力明显下降,处理后的菌片不能引致大豆茎基部发病,发病率为2%,即使发病不能导致明显的大豆茎基部的凹陷;而未经处理的菌片3d后可在接种的大豆引致明显茎基部的凹陷,有的已接近于大豆茎基部枯死,造成营养运输中断(图6,7),发病率为94%,经处理后发病率降低了97.9%。3不同培养天数对木霉代谢产物抑菌能力的影响3.1黄绿木霉菌与丝核菌作用后,丝核菌的菌丝生长受抑制,菌丝变形。3.2黄绿木霉代谢产物对菌核病丝核菌具有强的抑菌能力,该代谢物质可以经受高温高压的处理,并且在不同的培养基质条件下,代谢产物抑菌能力会有差别,其中以马铃薯葡萄糖培养基作为发酵基质,产物抑菌能力最强;在对不同发酵天数的实验中发现,黄绿木霉培养天数不同,代谢产物抑菌能力不同,以发酵3d,4d抑菌中浓度最低,发酵天数增加与减少均不利。故在利用代谢产物时,选择马铃薯葡萄糖培养基即可,发酵天数以4d为最佳。3.3黄绿木霉代谢产物对丝核菌处理过程中发现,丝核菌菌丝发生变化,细胞壁出现孔洞,并在电镜下变白