青龙病的研究进展

青龙病的研究进展

龙眼水果是一种代代相传的毁灭性疾病，是由韧皮部的细菌引起的。该病害可通过柑桔木虱在植株间传播,柑桔木虱有两种:即分布于亚洲和美洲的亚洲柑桔木虱和分布于非洲的非洲柑桔木虱。不管采用何种砧木,实际上所有柑桔栽培的种和品种都对柑桔黄龙病敏感。柑桔衰退病是柑桔的另一种毁灭性灾害,由柑桔速衰病毒(CTV)引起,导致酸橙(CitrusaurantiumL.)砧的柑桔迅速衰弱和死亡。通过更换酸橙砧木构成与接穗的耐病组合,使得衰退病得到了控制。许多衰退病流行的柑桔地区已经学会与衰退病共存。然而黄龙病除了防止树体被感染以外还没有别的防治措施。因而,黄龙病可能是柑桔最严重的病害,比衰退病严重得多,它对地中海盆地、西亚、澳大利亚和太平洋岛屿等尚无黄龙病的地区存在着严重的威胁。几年前,美洲尚无黄龙病。但在2004年3月和2005年8月,分别在巴西圣保罗州和美国佛罗里达州发现了黄龙病的症状,它们均是世界上最大的柑桔产区之一。这个发现使人们对黄龙病重新感起兴趣,这可从2005年11月在佛罗里达组织召开国际柑桔黄龙病工作研讨会得到证明。尽管在美洲才出现黄龙病,但它可能是柑桔上最古老的病害之一了。亚洲和非洲关于黄龙病已有过综述(GarnierandBove,1993;daGraca,1991;daGracaandKorsten,2004;HalbertandManjunath,2004),本文中,也会包含美洲的情况。直到1995年,该病害的名称以南非“青果病”的名称而广为人知。现在,最合适的中国名称“黄龙病”被定为正式名称(见下文)。本文中,无论该病害发生在哪个国家,一律以缩写“HLB”代表该病害的名称。1970年通过电镜发现了柑桔顽固病害的支原体病原菌(IgwegbeandCalavan,1970;LaflecheandBove,1970b)和黄龙病的细菌病原(LaflecheandBove,1970a)。1971年顽固病菌可以分离培养,1973年鉴定学名,发现该病的性质为Spiroplasmacitri(Saglioetal.,1973),2005年完成了基因组测序。但直到今天,黄龙病菌还不能够分离培养,这也是黄龙病菌的特性研究远不及S.citri快的原因。为了在系统发育学和分类学上研究黄龙病的特性,必须采用分子生物学技术。本文将重点放在黄龙病菌的本质及黄龙病的检测和确诊上。由于类菌原体和黄龙病菌还不能够分离培养,Koch的假说还不能够得到验证。然而,基于有力的间接证据,可推测出它们是引起相应病害的病原。本文将依据这个设想。历史背景中国的黄龙病Reinking(1919)在对中国南方经济作物病害考察时,于1919年用英文报道了柑桔的黄龙病,当时他认为黄龙病是一种不重要的病害。然而,后来的调查表明到1936年该病已发展成为很严重的病害了。林孔湘从1941到1955年对中国南方的黄龙病开展了最为详细的工作。林孔湘1910年出生在位于福建柑桔带内的村厦,于二十世纪三十年代末在康奈尔大学获得博士学位,回国后任教于广州的基督教教会学校岭南大学(即华南农业大学的前身),他把毕生大部分的精力都投入黄龙病研究访问。1941年到1955年,他开展了几次调查和田间访问,他在1943年访问了台湾,在那里发现了黄龙病,那时台湾当地称之为“立枯病”。在广东潮州走访的过程中,他从农民那了解到早在十九世纪七十年代当地就已有黄龙病了,通过多方面的观察,他推断中国南方的黄龙病就是从那里起源的。在潮州地区,农民把此病称为“黄龙病”,然而在其它地区该病还有各种不同的名称。林孔湘认为“黄龙”是最恰当的命名,因为“黄龙”或“黄梢”是当地农民对病树新发嫩梢的称呼,而这正代表该病典型的早期症状(见图6)。林孔湘最重要的成果是通过准确的实验证明了黄龙病不是由于缺素或涝害引起的生理性病害,也不是由线虫或镰刀菌引起的土传性病害,而是一种可通过嫁接传播的病害。之前,陈其保(1943)也得出了可“传播”的结论,但他仅仅是从患黄龙病的病梢嫁接繁殖得出的结论,林孔湘(1956)指出陈的失败之处在于没有提供证据证明黄龙病的系统侵染性。林孔湘的研究是在中国的困难时期开展的。他的研究成果发表于1956年。当时林孔湘的研究成果在中国以外的科学界鲜为人知,但至少有一位“西方”植物病理学家AntonioCiccarone教授不仅在1956年来广州考察期间得知了林孔湘的成果,并且尽力使林孔湘的成果为更多的人知晓。AntonioCiccarone教授1957年在意大利的刊物(RivistadiAgrumicoltura2∶45~50,1957)上发表了关于“黄梢”的简讯,以林孔湘1956年发表的论文为引用文献。AntonioCiccarone教授在简讯中正确的指出林孔湘的试验是在露天条件下进行的,一些未接种的植株也表现出了黄龙病症状。林孔湘也清楚的意识到这种情况,这促使他在1951年早期就着手第二次试验,该试验中他设了蕉柑区和柑区。以柑区为例,1954年末,112株未接种的柑对照及50株未接种的保护行的柑均未表现症状,然而接种的94株树中多达83株表现出黄龙病症状,22株未接种的保护行的柑中仅有4株显症。这些数据明显说明了黄龙病病原菌可通过嫁接传染,另外,对于一些未接种的树也感染了黄龙病,林孔湘推断存在传播媒介。很显然林孔湘第一个通过嫁接试验证明了黄龙病的传染本质,并贴切的采用了“黄龙病”的命名,基于以上原因,国际柑桔病毒学家组织(IOCV)于1995年在福州召开的第13届会议上提议将“黄龙病”定为正式的名称,该提议获得了通过,今天,黄龙病的名称已在非洲、美洲和亚洲广泛应用。南非的“青果病”南非的“青果病”与黄龙病相似,1928年发现了该病害,当时在德兰士瓦省西部称为“黄梢”,然而在德兰士瓦省东部普遍称为“青果病”(Oberholzeretal.,1965)。然而当时人们并未马上认识到“青果病”的本质,在1937年首次对该病进行描述时,推测是由矿物中毒引起的(vanderMerweandAndersen,1937)。在植物病理学家A.P.D.McClean(图1,B)和园艺学家P.C.J.Oberholzer的协力研究下终于在1965年得出“青果病”可通过嫁接传播(McCleanandOberholzer,1965a)和非洲柑桔木虱(McCleanandOberholzer,1965b)传播的结论。“青果病”的传染性终于明确了,但是这距离“黄龙病”传染性的明确已有十年了。菲律宾的“斑叶病”于1921年对菲律宾的“斑叶病”做了描述,当时认为是缺锌引起的(Lee,1921)。到二十世纪五十年代该病已成为一个严重问题。1966年Salibe和Cortze(1968)及Martinez和Wallace(1968)注意到了“斑叶病”与中国大陆和台湾的“黄龙病”及非洲“青果病”症状的相似。菲律宾对黄龙病最主要的贡献是在1967年证实了斑叶病”可由亚洲柑桔木虱传播(MartinezandWallace,1967)。同年,印度也报道了黄龙病可由亚洲柑桔木虱从罹患“柑桔梢枯病”的病株传播。印度的梢枯病和黄龙病很显然印度是另一个黄龙病发生历史悠久的国家,正如Cooper(1963)指出,印度的柑桔一直遭受某种严重的病害,导致柑桔减产、枝梢枯萎、慢性死亡甚至急速萎凋。基于这些症状,该病命名为“梢枯病”,在十八世纪印度引种柑桔不久,Bhonsale就首次在中部各省观察到“梢枯病”(Capoor引证,1963),Bonavia(1988)也在阿萨姆观察到这种病害。正如Asana(1958)所指出,印度关于“梢枯病”的问题在于“柑桔梢枯病不是一种特异性的病害”。与此相似,Capoor(1963)也认为梢枯病的症状是一种表象,它是由土壤病害、营养缺乏、枝梢真菌和病毒等因素引起的。在某些情况下,主要是由衰退病毒引起的,实际上,在孟买浦那的病毒研究中心已经清楚的证实了梢枯病的某些类型是由衰退病毒引起的(VasudevaandCapoor,1963)。另外一些情况可能和黄龙病有关,麦索北部的库格县很可能就是属于这种情况。Asana(1958)指出该地区的“病害最典型的症状就是其特有的斑驳叶”,这是非常中肯的观察,正如我们今天所知“斑驳”的确是黄龙病最典型的症状。几年后,正向斑点杂交技术证明了库格宽皮柑桔的斑驳叶片确实有黄龙病(Varmaetal.,1993)。1992年在印度召开了第十二届柑桔病毒学会议,与会成员看到在Chitalli和Gonicoppal的“库格”宽皮柑桔和其它柑桔品种上黄龙病发生的严重情况。1966年,Fraster和他的同事对黄龙病假说提供了进一步的支持(Frasteretal.,1966;FrasterandSingh,1968)。他们对梢枯病普遍是由衰退病引起的说法提出质疑,同时指出患梢枯病的树并非都存在衰退病毒。印度许多患病的柑桔种类在其它国家都是耐衰退病的。而且,梢枯病的症状与缺锌和其它微量元素引起的症状相似,施用这些微量元素有时能使梢枯病的症状得到暂时轻微的缓解,但并不能治愈梢枯病。这些观察资料表明梢枯病可能和黄龙病有关联,随后在印度所有的柑桔主产区开展了梢枯病的调查。调查过程中,发现了梢枯病一个显著的特征,即在患病早期,显症叶片总是局限在一个或几个分枝上,这个症状与McClean和Oberholzer(1965)对南非“青果病”及林孔湘(1956)对“黄龙病”的描述相同,但是如前所述,林孔湘的工作仍不为人所知。因此得出了“梢枯病和南非柑桔的青果病是由同一种病毒引起”的结论,但是这个结论只是基于症状观察,并没有得到实验的证实。在浦那的病毒研究中心,Capoor(图1C)和他的同事成功利用亚洲柑桔木虱传播了黄龙病病原菌,最终获得了毋庸置疑的证据证实了印度确实存在黄龙病(Capooretal.,1967)。他们利用木虱传播病原菌的技术,发现显示梢枯病症状的病株总是呈黄龙病阳性,在这些显示阳性的病株中,有的携带衰退病毒,有的并不携带衰退病毒。1971年,Bove和他的同事通过在亚洲柑桔木虱若虫感染了黄龙病菌“浦那”株系(无衰退病毒)的Musambi甜橙苗检测到黄龙病菌,这个材料是Capoor教授1969年惠赠的(LaflecheandBove,1970b;BoveandSaglio,1974)。波尔多实验室利用“浦那”黄龙病菌系取得了许多黄龙病方面的成果。印度尼西亚的“韧皮坏死病”和“叶脉韧皮部退化病”在印度尼西亚,黄龙病是一种主要的病害(Aubertetal.,1985;Boveetal.,2000b)。有趣的是,该病称为“叶脉韧皮部退化病”(Tirtawidjajaetal.,1965)。在对南非患黄龙病的甜橙梢进行解剖学研究时,Schneider发现在成熟叶片的维管束组织中都散落着局部坏死的韧皮部小穴,阻碍了输导。其它解剖上的变形,看来也是输导受引起的,即:在质粒中积累了大量的淀粉,形成层活性失常,使韧皮部过度形成并很快坏死。黄龙病的斑驳叶很可能就是这些变化导致的结果。黄龙病对泰国柑桔造成的破坏二十世纪六十年代在泰国发现了黄龙病,病害很严重,整株树从发病到衰弱仅需两年的时间(Schwarzetal.,1973)。Roistacher(1996)曾重点指出了泰国黄龙病的严重性和它对泰国柑桔造成的损失,每年泰国有10%~15%的柑桔树遭到黄龙病的破坏,并且北部许多柑桔产区的柑桔业破产。黄龙病除了通过亚洲柑桔木虱传播外,带病苗木的繁育也助长了其蔓延,确实,泰国是世界上为数不多的通过空中压条大规模繁育苗木的国家之一。电镜技术和黄龙病的细菌本质黄龙病病原体是革兰氏阴性菌到1967年,“黄龙病”的名称还未通用的时候,就确立了“青果病”可通过嫁接和两种柑桔木虱传播的结论。因为当时只知道病毒可通过这种方式传播,这在当时就意味着青果病是由病毒引起的,因此“青果病毒”的说法当时十分流行。同样的原因,“顽固病毒”的表达方式也见著于文献中(比如FraserandSingh,1968;SalibeandCortez,1968)。甚至由于青果病和顽固病有一些相同的症状而认为这两种病是由同种病毒的不同株系引起的。1967年,发现曾认为是由病毒引起的一些植物病害实际上是类菌原体引起的(Doietal.,1967)。支原体是一种特殊的细菌,没有细胞壁,仅包被着一层细胞质膜。大部分的“类菌原体病害”都属于“黄化”类型,它们的病症与青果病和顽固病相似。因此,法国的凡尔赛和波尔多实验室相继展开了利用电镜在感染青果病和顽固病的甜橙叶片中寻找类菌原体的研究。在两种病害显症叶片的韧皮部筛管中都检测到了微生物群,但在健康叶片中没有检测到。顽固病的微生物很快获得了分离培养,证明是一种新的支原体,呈螺旋形,能够运动,并命名为Spiroplasmacitri(Saglioetal.,1973)。青果病中的微生物无法分离培养,开始认为也是一种支原体(LaflecheandBove,1970a,b),但是很快发现病原体的外面包被着25nm厚的包膜,这比柑桔螺原体(图3E)等支原体典型的7~10nm厚的细胞质膜厚得多(Saglioetal.,1971;Garnieretal.,1976)。这些性质表明黄龙病病原菌除了具有细胞质膜外,还具有细菌的细胞壁。后来发现确实如此,细胞壁属于革兰氏阴性菌型,由一层膜和肽聚糖层构成(GarnierandBove,1977;Garnieretal.,1984a)。因此,黄龙病病原体是一种革兰氏阴性菌(Garnieretal.,1984b)如Garnier和Bove所示在电镜传统的样品固定程序中,黄龙病病原菌的细胞壁看起来是一层典型的电子高密度层围绕着细菌细胞(图3B,D)这对于黄龙病鉴定,已经足够了。采用特殊的固定方法可看出细胞膜有三层超微结构,黄龙病菌由两个这样的三层膜包被着(图3C),即:内层细胞质膜和外层细胞质膜,这是革兰氏阴性菌细胞壁的一部分(GarnierandBove,1977;MollandMartin,1974)。在这种条件下,一般是看不到肽聚糖层(PG)的,但是有时细胞壁膜的内层比外层稍微厚些,电子密度也高些,使人联想到这是肽聚糖层。电镜观察肽聚糖层(图3F,G)需采用细胞化学的手段,利用木瓜蛋白酶把肽聚糖层从细胞壁膜上分离,再用溶解酵素消化肽聚糖层,以确认是肽聚糖层(Garnieretal.,1984a,b)。在对照实验中,采用革兰氏阴性菌Escherichiacoli也得到了同样的结果,但采用革兰氏阳性菌Staphylococcusaureus(图3)没得到该结果。在上述电镜实验之前,研究盘尼西林对感染黄龙病植株的作用效果时,就得到了黄龙病菌为革兰氏阴性菌的间接证据。盘尼西林对生物合成肽聚糖的后面一步(转肽作用)起抑制作用。把抗生素根施在温室中生长的甜橙植株上(Boveetal.,1980),并在留尼汪岛田间用特洛亚枳橙作砧木的甜橙用树干注射的方法(AubertandBove,1980),两种情况下,盘尼西林对感染黄龙病的树都有好的效果。盘尼西林处理过的显症树与未处理的对照相比较,拥有更好的根系、长出了旺盛的无症枝梢和叶片。在新长出的无症叶片的筛管中没有发现黄龙病菌。然而,处理一旦停止,病菌和症状就会重新出现。正如所料,盘尼西林对感染螺原体的柑桔是没有作用的,由于支原体没有细胞壁和肽聚糖层,所以对盘尼西林不敏感。通过电镜,首先,在感染南非“青果病”的甜橙叶片中检测到了黄龙病菌(LaflecheandBove,1970a),很快在感染留尼汪岛“青果病”、印度“梢枯病”、台湾“立枯病”、菲律宾“斑叶病”的叶片中也发现了类似的细菌(LaflecheandBove,1970b;BoveandSaglio,1974)。这些资料通过陈等(1971)对立枯病、Tanaka和Doi(1973)对立枯病和斑叶病的研究得到了证实。1979年,在中国南方的黄龙病树上也发现了同样的病原菌(Chenetal.,1979a,b;Keetal.,1979)。最后,在非洲柑桔木虱(MollandMartin,1973)和亚洲柑桔木虱(Chenetal.,1973)中也发现了黄龙病菌。黄龙病菌可能是植物中发现的首个具壁、寄生限于筛管的细菌。类似黄龙病菌的细菌也发生在除柑桔以外的植物上,引起的病害有20多种如木瓜束顶病(Davisetal.,1996)、西瓜黄蔓病(Brutonetal.,1998)、草莓边缘褪绿病(Zreiketal.,1998)、甜菜低糖综合症(Gatieauetal.,2002)等。这些相关的细菌都限制在韧皮部的筛管中,都还不能分离培养,并通过叶蝉或木虱传播。关于黄龙病菌为类菌原体的出版物见于1970年(LaflecheandBove,1970a,b)。然而,如前所讲,Bove和他小组的成员早在1971年就对黄龙病菌本质为支原体提出质疑(Saglioetal.,1971),上世纪70年代,他们提出大量的论据反对支原体假说,直到1984年最终证明了黄龙病菌为革兰氏阴性菌(GarnierandBove,1984a,b)。然而直到上世纪80年代还有几个出版物沿用“类菌原体”的错误说法。电镜:首个鉴定和确认黄龙病的实验室技术并不存在特异的黄龙病症状,一些症状譬如黄梢、叶片斑驳、反向着色和种子败育的畸形果等都是典型的,但这些症状不一定在一株树上同时发生,它们可能与其它病害的症状混淆或受其它病害隐蔽,亦可能是其他原因引起的。譬如:黄龙病引起的缺锌症状与真正的缺锌症状很难区分,疫霉流胶病会引起黄梢,空中压条时环割会导致叶片斑驳,柑桔顽固病和黄龙病有共同的症状。现在还未发现同时发生这两种病的国家,但将来可能会出现这种情况。由于这多方面的原因,就需要建立一个明确检测黄龙病的技术。我们实验室在MoniqueGarnier的带领下,多年致力于电镜检测黄龙病菌的技术研究(如Aubertetal.,1988;BoveandGarnier,1984;Catlingetal.,1978;GarnierandBove,1996)。电镜的可靠性和特异性基于黄龙病菌的两个特性:其筛管中独有的位置(图3A)和具有细胞壁(图3B,D),在柑桔中除黄龙病菌外没有其它病菌具有这两个特征。电镜检测黄龙病菌,需采用叶片的中脉。如果筛管中病菌的含量比较低,建议采用筛管细胞纵向的切面。多年来利用黄龙病电镜检测亚洲和非洲黄龙病的经验显示:严重斑驳叶片筛管中黄龙病菌的含量比轻微斑驳叶片筛管中的含量要高,因而,要优先采用严重斑驳症状的叶片,无症状叶片是没有用处的。电镜检测确定黄龙病时,一个切面至少有一个病菌显示围绕细胞有电子密集的细胞壁层,通常只有在细胞的默写特定部分才能看到该层(图3B,D)。有时,为了观察到具有“好的”细胞壁的细菌不得不检测好几个切面(图3B,D)。最后,许多的电镜检测表明,无法在形态学上区别黄龙病菌的亚洲种和非洲种。HLB的几种类型:亚洲的、非洲的和美洲的病树生长地点的温度影响柑桔黄龙病和顽固病的症状表现。在加利福尼亚州、亚利桑那州、摩洛哥、伊朗和伊拉克等高温干燥地区,柑桔顽固病的症状严重。在南非,黄龙病和它的传播媒介非洲柑桔木虱都存在于德兰士瓦省和斯威士兰的凉爽的高地,在斯威士兰较炎热的低地地区却没有分布。然而在开普省,高纬度补偿了低海拔,其气候温和,也有黄龙病及非洲柑桔木虱分布。在马达加斯加岛,黄龙病和非洲柑桔木虱仅存在于中心高原地区(海拔1200~1500m),而在低海拔的海岸地区没有分布。与之相反,在肯尼亚海拔600~700m以下没有黄龙病和非洲柑桔木虱存在。不同的是,在亚洲,黄龙病和亚洲柑桔木虱分布在炎热的低海拔地区,例如,1984年在印度尼西亚整个爪哇海岸低地,都有黄龙病和亚洲柑桔木虱发生,但在海拔800~1200m果园中的许多柑桔树还是健康的(Aubertetal.,1985)。在北巴厘岛地区黄龙病普遍存在于海拔650m以下的地区,但在海拔超过1000m的地区,却罕有发生,这种分布也反应了柑桔木虱的分布情况(Boveetal.,2000b)。类似的是,在中国四川宁南地区(中国南部)海拔1090~1200m间柑桔木虱分布很多,100%的柑桔树都感染了黄龙病,而在海拔1385~1620m间,并且没有发现柑桔木虱,黄龙病的发病率只有3%。在1969年开始的国际合作实验中,也进行了温度对黄龙病症状的研究。实验在两个人工气候箱进行,分别为“冷凉箱”(24℃16h光照培养,22℃8h暗培养)和“温暖箱”(32℃16h光照培养,27℃8h暗培养)。把南非的“青果病”(内尔斯普雷特),印度“梢枯病”(浦那)和菲律宾“斑叶病”(里帕市)的黄龙病病原菌分别嫁接接种到甜橙上,并用电镜证明了这些接种体中确实存在黄龙病病原菌。接种南非黄龙病的甜橙在“冷凉箱”中培养30周后表现严重症状,病株平均株高为35cm,而在“温暖箱”中培养的则没有表现症状,株高达到了190cm。把在“冷凉箱”中培养40周后表现明显症状的植株转移到温暖的培养环境中,这些植株迅速抽出旺盛的新梢,树体恢复了,在接下来十个月的实验中,没在产生症状。印度黄龙病和菲律宾黄龙病在22~24℃和27~32℃培养中都可显症。在“温暖箱”中培养30周后,感染印度黄龙病和菲律宾黄龙病的显症苗木的平均株高分别为25cm和40cm,而健康对照的株高则达到180cm和140cm。此次实验的结果与大田观察一致表明非洲型黄龙病为热敏感型,只发生在温度低于30~32℃的冷凉地区。相似的,非洲柑桔木虱也对高温低湿比较敏感只存在于冷凉环境中(Catling,1969c)。相反的,亚洲型黄龙病为耐热型,即使在30℃以上也会显症。亚洲柑桔木虱具有相似的特征,也为耐热型。黄龙病菌的南非内尔斯普雷特株系和印度浦那株系都可传到长春花(Catharanthusroseus)(见下文)。用感病的长春花做温度实验的结果和用感病的柑桔苗的实验结果是一样的。感染印度黄龙病病原菌的长春花在25℃和32℃时都会显症,而感染南非黄龙病病原菌的只在25℃时显症(GarnierandBove,1983)。温度对长春花和柑桔显症的影响是一致的,因此温度对症状的作用效果取决于黄龙病病原菌类型,而与寄生植物无关。非洲型黄龙病病原菌是热敏感型的,而亚洲型黄龙病病原菌是耐热型的,这种生物学差异表明非洲和亚洲的黄龙病病原菌是不同的。事实上,如下文所述它们的确代表了不同的病原菌种类:非洲种黄龙病原菌(CandidatusLiberibacterafricanus)和亚洲种黄龙病菌(CandidatusLiberibacterasiaticus)。非洲种黄龙病病菌和非洲柑桔木虱都是热敏感型,亚洲种黄龙病病菌和亚洲柑桔木虱都是耐热型,这看似是传病媒介和病原菌相互适应的一个很好的例子,但是值得注意的是至少在实验条件下两种木虱都可以传播这两种黄龙病病原菌的任意一种(Massonieetal.,1976;Lallemandetal.,1986)。巴西圣保罗州感染亚洲种病原菌的黄龙病病树不到10%。病树中的90%以上感染了新发现的第三种病原菌—美洲种黄龙病菌(CandidatusLiberibacteramericanus)。早在1942年,圣保罗就有亚洲柑桔木虱的报道,它不仅传播亚洲种病原菌,很可能也传播美洲种病原菌。在感染美洲种病原菌的树上收集亚洲柑桔木虱进行PCR检测,发现其体内确实含有美洲种黄龙病病菌。而且在温室中嫁接接种美洲种病原菌的甜橙苗在冷凉(22~24℃)和温暖(27~32℃)条件下都表现明显的叶片斑驳症状(Teixeiraetal.,2005c)。这些实验和研究都表明巴西的黄龙病属于耐热型。1998年在佛罗里达发现了亚洲柑桔木虱(Halbert,1998)。2005年8月,在该州南部看到有黄龙病,在染病植株中只检测到亚洲种黄龙病菌,因而美国的黄龙病也可能属于耐热型。黄龙病菌通过菟丝子从柑桔传到长春花在柑桔中,黄龙病菌含量很低,但在菟丝子(Cuscutacampestris)中细菌量可达到高浓度(Ghoshetal.,1977)。长春花(Catharanthusroseus)是一种寄主植物,许多类菌原体可在其筛管中旺盛的繁殖。这些研究表明可尝试通过菟丝子将黄龙病菌从柑桔传到长春花,也确实得到了有效的传播(GarnierandBove,1983)。实验中,由菟丝子把四株长春花与感染印度黄龙病的甜橙苗连接起来,其中一株长春花表现特有的黄化症状,筛管中有类似黄龙病菌的细菌并且在一些筛管中含量特别高。把显症长春花的芽高接到健康的长春花上,在25℃的条件下,3个月后也产生了典型的症状。采用这种方法生产了大量显症的感染黄龙病的长春花。南非、中国和菲律宾的黄龙病株系也取得了类似的结果。必须强调的是从没发现自然条件下长春花感染黄龙病的情况。柑桔木虱不会把黄龙病菌传播给它不喜欢取食的长春花,如果被强制呆在长春花上,柑桔木虱就会死亡。采用感染黄龙病的长春花制成超薄切片进行电镜观察,结果证明黄龙病菌为革兰氏阴性菌(Garnieretal.,1984a,b)(见上文)。由于黄龙病菌不能够分离培养,大量感病的长春花成为黄龙病菌系统发育学和分类学的特征研究、生产单克隆抗体及建立分子检测技术的便利材料(见上文)。由菟丝子向烟草(NicotianatabacumXanthi)传播黄龙病菌也获得了成功(GarnierandBove,1993)。非洲种和亚洲种黄龙病菌的系统发育学和分类学的特征16SrDNA为确定黄龙病菌在系统发育学中的地位,把从感染黄龙病的长春花中提取的总DNA中利用通用引物f-D1/r-P1进行原核16SrDNAPCR扩增,得到了南非内尔斯普雷特株系和亚洲浦那株系的16SrDNA,(Weisburgetal.,1991)。实验过程中,必须防止长春花线粒体和叶绿体16SrDNA的干扰。这可通过在PCR扩增前用核酸内切酶Bcl1切除线粒体16SrDNA得到解决。扩增得到的DNA约1500个碱基对(bp),包括细菌的16SrDNA和叶绿体的16SrDNA。可通过EcoRI探明细菌DNA的存在,EcoRI可把细菌切成两个片断(~650bp和~850bp),而不会触及叶绿体DNA。从~1500bp的扩增产物中克隆得到了16SrDNA并进行了测序。采用对扩增序列专一的寡核苷酸进行杂交和PCR实验,结果表明得到的DNA的确是黄龙病菌的16SrDNA而不是污染微生物的DNA(Jagoueixetal.,1994)。与国际基因库的16SrDNA序列的比较结果,非洲种和亚洲种黄龙病菌属于变形菌纲的α亚纲。尽管黄龙病病原菌与α-2亚组的成员亲缘关系很近,但是黄龙病菌与该组成员有明显的不同,16SrDNA序列的同源性仅为87.5%。因而,这两种黄龙病病原菌代表着变形菌纲α亚纲中一个新的分支,由于该纲成员属于革兰氏阴性细菌,因此黄龙病菌本质为革兰氏阴性细菌,其实Garnier等已从以前的电镜研究中得出了黄龙病菌本质为革兰氏阴性细菌的推论(1984a,b)。变形菌纲的α亚纲包括多种多样的微生物,即包括具有不同特性的植物病原体或共生体(Agrobacteriumtumefaciens,Bradyrhizobiumspp.)又包括人类病原体(Rochalimeaspp.,Bartonellabaciliformis,Brucellaabortus,Afipiaspp.,等)。这个亚纲的有机体的生长与真核细胞密切联系,许多情况下具备在节肢动物媒介体内生存和生长的能力。这个描述非常适合黄龙病菌。黄龙病菌确实在真核植物寄主的韧皮部筛管这个小生境中生长,并且通过两种节肢动物亚洲柑桔木虱和非洲柑桔木虱进行传播,并可在柑桔木虱的血淋巴和唾腺内繁殖。RplKAJL-rpoBC操纵子和DNA探针利用从感染黄龙病亚洲浦那(印度)株系的长春花提取的总DNA,通过随机克隆获得细菌基因组的几个DNA片断(Villechanouxetal.,1992)。采用In-2.6(2.6kbp)片断作为探针进行Southern或斑点杂交时,与所有检测过的亚洲黄龙病株系高严谨杂交,但与非洲株系不存在这种情况。尽管有时也可与非洲株系杂交,但仅能低严紧杂交或中度杂交。与浦那In-2.6探针杂交显示阳性的亚洲株系分别来自浦那(印度)(同源株系)、那空拍侬府(泰国)、里帕市(菲律宾)、福建(中国)、台湾和巴厘(印度尼西亚)。通过测序发现In-2.6是RplKAJL-rpoBC基因簇的一部分,即为众所周知的细菌β操纵子的一部分,该操纵子负责编码核糖体蛋白K、A、J、L及RNA聚合酶亚单位β和β’(Villechanouxetal.,1993)。根据In-2.6的序列设计了f-1898,r-1897两个PCR引物对非洲内尔斯普雷特黄龙病菌的RplKAJL-rpoBC操纵子的一部分进行扩增(Planetetal.,1995),得到了约1700bp大小的清晰的DNA带。通过克隆和测序,非洲株系的DNA(1676bp)确实与预料中的β操纵子的一部分相吻合,该部分称为AS-1.7。AS-1.7可与感染非洲内尔斯普雷特株系的柑桔或长春花的DNA高严谨杂交,但没有发现与检测过的亚洲株系杂交的情况(Planetetal.,1995)。如前所述,In-2.6用作探针时得到了相反的杂交结果:与非洲株系不杂交,与所有检测过的亚洲株系高严谨杂交。In-2.6与AS-1.7所有核苷酸的同源性仅为74.2%。相似基因同源性低,正是In-2.6与感染非洲黄龙病菌的长春花DNA不产生杂交的原因,反之亦然。这么低的同源性也可推测说明非洲种黄龙病菌株系和亚洲种黄龙病菌株系为同属的两个不同的种(Jagoueixetal.,1994;Planetetal.,1995)。单克隆抗体由于黄龙病菌无法分离培养,自1987年仅研制了13个不同的针对黄龙病菌的单克隆抗体(MA)(Garnieretal.,1991;Gaoetal.,1993)。前10个单克隆抗体是用感染黄龙病的长春花韧皮部作免疫原匀浆制备的。这些抗体中,有两个(包括MA10A6)可识别印度浦那株系,五个可识别来自中国(福建)的株系,三个识别南非内尔斯普雷特株系。利用这些单克隆抗体检测黄龙病菌表明每个单克隆抗体对用作免疫原的株系特异性很强,因而无法用于黄龙病的一般性诊断(Garnieretal.,1991)。为了研制出识别大部分或所有黄龙病菌株系的抗体,采用免疫亲和色谱法以MA10A6针对印度浦那株系的抗体蛋白使其纯化,并用于脾细胞的体外免疫(Gaoetal.,1993)。共得到了3个单克隆抗体,其中一个(1A5)可识别除了中国株系外的所有检测过的亚洲株系,另外两个可识别中国株系外的大部分亚洲株系。这3个株系对非洲株系都无反应。这个结果与DNA探针获得的结果是相一致的,再次证明了亚洲种和非洲种黄龙病菌是两个不同的种。用MA10A6结合CNBr活化的琼脂糖4B,可成功地通过免疫亲和纯化黄龙病菌浦那株系(Villechanouxetal.,1990)。采用这种方法,可在电镜中首次观察到纯化的黄龙病菌细胞。候选的属和种:非洲种和亚洲种黄龙病菌细菌学家给未能分离培养的细菌命名拉丁名时,态度比较谨慎。但是,随着PCR扩增和DNA测序的进展,使得在分子水平和系统发育水平描述未能分离培养细菌成为可能。基于这样的考虑,Murray和Schleifer(1994)提议把“Candidatus”作为名称,反映分类学上的过渡状态,这在属和种的水平上为基于序列的潜在的新的分类提供了合适的安排。黄龙病菌通过16SrDNA序列比对成为变形菌纲α亚纲一个新亚组的