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文档简介

动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定酶从动物组织中分离提取酶一、实验原理细胞内不同的亚细胞组分其比重、大小和形态都不相同，在同一离心场内或不同密度介质条件下离心时其沉降速度也不相同。根据这一原理，常用差速离心法和密度离心法将细胞内各种组分分离出来。二、材料与试剂1.饥饿24小时的小鼠2.试剂：

生理盐水(0.9%NaCl)，0.25M蔗糖溶液3.器材

解剖器、搪瓷盘、烧杯、塑料滴管、玻璃滴管、漏斗、离心管

纱布、脱脂棉、冰块

玻璃匀浆机、离心机、天平三、实验步骤

1.获取肝脏匀浆液

饥饿24h的小鼠处死，剖腹，取肝

生理盐水冲洗肝脏，吸脂棉吸水，取适量肝脏

在冰块中用剪碎肝脏，0.25M冰冷蔗糖水洗三次

移入插在冰块中的匀浆器中匀浆

分次加入0.25M冰冷蔗糖10ml

经32层纱布过滤（纱布事先用蔗糖水浸湿）

得匀浆液

2.梯度离心获得含有酶的细胞液

离心管中加入5ml0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻轻覆在其上，1600r/min离心10min，得上清液（1）

沉淀加10ml0.25M蔗糖混匀，3500r/min离心10min，得上清液（2）

将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min离心10min，得上清液，即为酶体和微粒体

盐析法提酶一、实验原理中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小。大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。二、实验材料

固体硫酸铵、蒸馏水、稀硫酸、氨水

PH计

三、实验步骤

配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀硫酸或氨水调PH到6.2

将酶溶液与硫酸铵溶液混合，静止一段时间

离心，去上清，留沉淀

加蒸馏水溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶的溶液离子交换柱层析法纯化蛋白质一、实验原理混合物在经过固定相和流动相的过程中，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，由于其中各组分间在理化性质上存在着差异，因此当它们经过上述相同重复过程时，各自的情况就有会所不同，从而使各物质得以分离。离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE—纤维素），当被分离的蛋白

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