烟草青枯病抗性苗期鉴定方法的建立与应用

烟草青枯病抗性苗期鉴定方法的建立与应用

草青霉病是由草绿霉病引起的，主要是由根管引起的土壤传递疾病。它在中国南方的烟带中广泛发生，并对牧草生产产生重大影响。选育与种植抗病品种是控制青枯病发生与流行的经济有效的防治措施。但在抗病育种相关研究中,需要准确快速评价大量材料的抗性表现。大田青枯病抗性鉴定因为每年只能鉴定一次、所需病圃面积大、发病不均匀,不能满足上述要求,而且还存在供试材料的抗性表现年份间和地点间差异较大等问题。苗期抗性鉴定有利于解决病圃面积不够的问题。青枯病苗期接种方法主要有伤根灌注法、浸根法、毛细管刺茎渗透法、剪叶接种法及离体水培法等。其中伤根灌注法接种能引起严重的侵染,接种效果相对稳定,与病区自然发病鉴定结果之间的相关性高,剪叶接种法和离体水培法与病害自然侵染过程的差异大,毛细管刺茎渗透法和剪叶接种法的接种效果不稳定,且与品种在病区抗性表现的相关性偏低。伤根灌注法接种实验中,土壤温度和接种菌浓度显著影响烟苗的发病程度。苗期土壤盆栽抗性鉴定,在无控温设备的塑料拱棚温室中,当实验期间气温偏低时,经常出现发病缓慢、发病不严重等问题。苗期水培抗性鉴定在茄子、番茄抗青枯病研究中得到成功的应用。我国烟草普遍采用漂浮育苗,因此,建立烟草青枯病抗性的漂浮池水培接种鉴定方法,对抗病种质资源筛选、抗性遗传特性研究和抗病育种具有重要意义。1材料和方法1.1菌株培养及活性测定供试烟草材料岩烟97、EnshuFC、Oxford207、K326和红花大金元,为国内外报道的抗、感青枯病资源。以NC95为抗病对照,Hicks为感病对照。青枯菌强致病力菌株Y45,分离自云南省文山州麻栗坡县麻栗镇。菌种保存在无菌水中,使用时在TTC培养基上活化48h,挑典型单菌落至TTC平板培养基上,28℃培养48h。将菌苔刮下,接种到1/10BG培养液,28℃震荡培养36~48h。培养液于5000×g离心15min收集菌体,用井水或过夜自来水配成浓度为109cfu/mL(OD600=2.0)的菌悬液,用于接种。1.2温度和温度条件对青枯病的影响2007年5月至6月,在云南省烟草科学研究所研和试验基地塑料拱棚温室内进行。池水保温循环漂浮池建造方法为池底垫一层厚约4cm的泡沫塑料板,铺2层池膜,整个池壁四周用泡沫塑料板保温。苗池一端设控温电加热棒(中山超信电器厂产品)和池水循环泵(广东海利集团有限公司产品)。电加热棒和池水循环泵通过控温装置联动。根据青枯病适宜发病温度和云南病区土温设置水温为26.5℃。采用自动温湿度记录仪(杭州哈泰克公司产品)每小时记录一次水温。烟苗两次剪叶后(苗龄50d),每个材料挑选45株,移植到新的漂浮盘中。在漂浮池中加入青枯菌悬液,根据菌悬液OD600值,调整池水中菌浓度至108cfu/mL。施入育苗专用肥料[m(N):m(P2O5):m(K2O)=20:10:20],控制氮素浓度为150mg/kg。为排除黑胫病的影响,在水中施入58%甲霜灵锰锌。根据池水蒸发量,经常补充池水至初始水深。接种后每隔2d采样,采用TTC平板梯度稀释法测定池水中青枯菌浓度,为排除杂菌的干扰,只统计典型的有致病力的青枯菌菌落数量。接种后10d调查发病情况,以后每隔2~3d调查一次发病情况。记录发病率及病情指数。以感病对照发病率达到80%左右的调查结果作为品种抗性评价标准。1.3病情发展曲线audpc病害严重度分级标准参考CORESTA方法:0级:全株无病;1级:茎部褪绿条斑不超过三分之一株高,或只有一片叶变黄或枯萎;2级:多于2片叶变黄或枯萎且健叶多于3片,或茎部褪绿条斑在1/3~1/2株高处;3级:健叶1~3片,或茎部褪绿条斑在1/2~2/3株高处;4级:植株基本枯死,茎部褪绿条斑超过2/3株高,无健叶(指可烤叶)。将病情指数换算为相对病情指数。相对病情指数=品种病指×校正系数K值,K=感病对照规定病指95.0/感病对照实际病指。抗性评价标准:高抗(HR)、抗病(R)、中抗(MR)、中感(MS)、感病(S)、高感(HS)其相对病情指数分别为0~20、21~40、41~60、61~80、81~90、91~100。病情发展曲线下面积(AUDPC)计算公式:AUDPC=Σ[(Xi+Xi+1)/2]×Ti,式中的Xi、Xi+1分别是第i次记载和第i+1次记载的病害严重度,Ti是第i次记载和第i+1次记载之间所间隔的天数。采用烟草科研统计分析软件的典型相关程序计算相关系数。2结果2.1田间病情指数在云南省烟科所塑料拱棚温室内,在苗期漂浮池恒温水培接种试验中,感病对照Hicks接种后第11天开始零星发病,随后发病迅速,且无其他病害干扰。接种后第21天和第27天感病对照Hicks病指分别达到37.9和71.7。接种后第21天和第27天抗病对照NC95病指分别为8.2和19.0。不同抗性品种的病情指数差异明显(图1)。NC95(抗病对照)、K326(低抗-中抗)、Hicks(感病对照)、红花大金元(高感)的病指曲线下面积分别为145.8、380.6、599.6和545.1,病指曲线下面积值与品种本身抗性相吻合。接种青枯菌菌液后,除两次短时间停电外,池水白天和夜晚的平均温度始终维持在26.0~27.0℃(图2)。池水温度稳定在26℃以上,保证了青枯病发病迅速。接种当时取样,TTC平板测定池水中有致病力的青枯菌浓度为4.2×108cfu/mL,接种后2、4、6d取样测定,池水中青枯菌浓度分别为4.0×106、7.0×106、4.3×106cfu/mL。烟苗病株症状表现为茎基部一侧黑色坏死条斑,随后整株萎焉、死亡;叶片黄化症状不明显。未见其他病害的干扰。2.2sf7、气力理试验在苗期漂浮池恒温水培抗性鉴定中,已知抗青枯病的岩烟97、EnshuFC、Oxford207和NC95表现为高抗,低抗至中抗的K326表现为中抗,感病对照Hicks表现为感病,高感的红花大金元表现为高感。漂浮池恒温水培接种鉴定的结果与品种本身抗性基本吻合(表1)。3漂浮池水培法鉴定的必要性病田自然发病鉴定能很好反应品种的真实抗性,但鉴定材料数量受田块面积和工作量的限制,鉴定结果年度间受菌株种群和致病力差异、气候差异和其他病害的影响。青枯病人工接种,烟苗发病速度和发病严重度受土壤温度和接种菌量的影响很大,土壤温度维持在30℃和35℃,烟苗发病最重,土壤接种菌量增加,烟苗发病加快加重。在塑料拱棚温室中均匀提高土壤温度难度大,恒温温室造价高。本研究通过在普通漂浮池基础上,增加简单的保温材料、加热控温设备和水循环泵,以低成本成功解决了温度问题。漂浮池恒温水培鉴定可在1个月之内完成,使得提高烟苗密度、减少水培面积可行,从而大幅度减少接种菌的数量;在整个鉴定过程中、池水中青枯菌浓度和温度均匀一致,保证了重复间发病的均匀性。病原菌从根部侵入,接近病害田间自然侵染过程,保证了抗性鉴定结果的可靠性。通过调整水温和池水接种青枯菌数量,可灵活控制烟苗发病的速度,满足不同实验需要。4漂浮池水培鉴定法漂浮池恒温水培鉴定方法具有如下优点:发病迅速,从接种到调查结束可在一个月内完成;占地面积小,在几十平方米的面积上一次可同时鉴定上千株烟苗;结果重现性高,能有效排除土壤温度差异、菌株致病力差异、菌量差异和其他病害对抗性结果的干扰,有利于年度间和不同实验室间结果重现和比较;结果可靠性高,抗感品种的发病率和病情指数差异明显,品种的抗性评价结果与他人多年的抗性评价结果基本一致。该方法在抗病资源和育种中间材料的抗性鉴定、抗性遗传规律研究中应用潜力较大。漂浮池恒温水培鉴