微生物限度检查标准操作规程

微生物程度检查原则操作规程1.目的：建立一种微生物程度检查原则操作规程。2.范畴：我司的药品、原辅料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作人员。3.职责：微生物程度检查人员对实施本程序负责。4.规程：4.1取样：按各《取样原则操作程序》，应随机抽取不少于检查用量（两个以上最少包装单位）的3倍量供试品。每份供试品最低应取2个以上最少包装单位，膜剂不得少于4片。4.2培养基的制备：按“培养基制备原则操作规程”。4.3稀释剂的制备：称取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液14.63g，置1000ml三角瓶中，加纯化水1000ml，摇匀，加热溶解,于121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。4.4检查量：除另有规定外，每份供试品最低应取2个以上最小包装单位，膜剂不得少于4片。普通供试品的检查量为10g或10ml；中药膜剂为100cm2。规定检查沙门菌的供试品，其检查量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照实验）。4.5实验前的准备：4.5.1将全部已灭菌的平皿，三角瓶、吸管、量杯、研钵、稀释剂及供试品等移至无菌室的传递窗内，打开紫外灯消毒15min，风淋10s。4.5.2启动无菌室紫外线灭菌灯20分钟。4.5.3关闭紫外线灭菌灯，进入缓冲一室，用肥皂洗手，换工作鞋，除外衣；进入缓冲二室，穿戴无菌衣、帽、口罩，用消毒剂消毒双手，戴上手套，进入操作间。4.5.4启开工作台，用乙醇棉球擦手及供试品瓶、盒、袋等的开口处周边，待干后用灭菌剪刀将供试品启封。4.6操作:4.6.1供试液的制备:4.6.1.1固体、半固体或黏稠性供试品:取供试品10g,置灭菌研钵中,以100ml稀释剂分次加入研磨,混匀使成1:10供试液。4.6.1.2液体供试品：取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，充足摇匀，即为1:10供试液，也可取原液作为供试液。4.6.1.3胶囊剂和空心胶囊供试品：取供试品10g，分离囊帽与囊身，同置灭菌锥形瓶中，加100ml稀释剂。振摇使溶，直至内容物完全分散或溶解，即为1:10供试液。4.6.1.4口服固体药用高密度聚乙烯瓶：取供试品数只，加入1/2标示容量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将盖盖紧，振摇1分钟，即得供试液。用无菌吸管吸取供试液1ml，加入9ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，即为1:10供试液。4.6.1.5药用PVC硬片和铝箔：取供试品用开孔面积为20cm²的无菌的金属模板压在内层面上，将无菌棉签用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稍沾湿，在板孔范畴内擦抹5次，换1支棉签再擦抹5次，每个位置用2支棉签共擦抹10次，共擦抹5个位置100cm²。每支棉签抹完后立刻剪断，投入盛有30mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角瓶中。全部擦抹棉签投入瓶中后，将瓶快速摇晃1分钟，静置10分钟，即得供试液。用无菌吸管吸取供试液1ml，加入9ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，即为1:10供试液。4.6.1.6需用特殊办法制备供试液的供试品：4.6.1.6.1油脂类供试品：取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其它无抑菌性表面活性剂充足混匀。表面活性剂的温度普通不超出40℃（特殊状况下，最多不超出45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成1:10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。4.6.1.6.2膜剂供试品：取供试品10cm2,，剪碎，加稀释液100ml，浸泡，振摇，作为1:10的供试液；必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。4.6.1.6.3具抑菌活性的供试品：当供试品有抑菌活性时，采用下列办法进行解决，以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。（1）增加稀释液或培养基体积。（2)加入适宜的中和剂或灭火剂。(3)薄膜过滤法（见本文4.8)。4.6.2供试品的稀释用无菌吸管吸取1：10供试液1ml，加入9ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀。即为1:102供试液。用无菌吸管吸取1:102供试液1ml，加入9ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀。即为1:103供试液。4.7供试品需氧菌、酵母菌和霉菌的检查：涉及平皿法和薄膜过滤法，除纯化水、口服固体药用高密度聚乙烯瓶和药用PVC硬片和铝箔用薄膜过滤法外，其它普通都用平皿法。检查时，按已验证的计数办法进行供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的测定（验证办法见附录1）。4.7.1需氧菌总数的检查：用无菌吸管吸取各稀释级的供试液1ml，置于直径90mm的无菌平皿中，加入15~20ml温度不超出45℃已融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，轻轻摇动混合均匀，凝固，倒置培养皿，放在生化培养箱中，30~35℃培养72~120h。各稀释级的培养基最少制备2个平板。4.7.2霉菌和酵母菌总数的检查：用无菌吸管吸取各稀释级的供试液1ml，置于直径90mm的无菌平皿中，加入15~20ml温度不超出45℃已融化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，轻轻摇动混合均匀，凝固，倒置培养皿，放在霉菌培养箱中，20~25℃培养72~120h。各稀释级的培养基最少制备2个平板。4.7.3阴性对照实验：取实验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用培养基最少制备2个平板注：①普通状况下，固体供试品需氧菌总数检查需做101、102、103三个稀释级，液体供试品和液体塑料瓶只需做101、102两个稀释级。霉菌和酵母菌总数检查需做101、102两个稀释级。②胰酪大豆胨琼脂培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数；若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数成果不符合微生物程度规定，可使用含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其它选择性培养基进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培养基时，应进行培养基合用性检查。4.7.4计数：除另有规定外，需氧菌培养3天，霉菌及酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长状况；点计平板上生长的全部菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不适宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级2个平板的菌落平均数不不大于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。4.7.5菌数报告规则：需氧菌总数测定宜选用平均菌落数不大于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数宜选用平均菌落数不大于100cfu的稀释级，作为菌数报告(取两位有效数字)的根据。以最高的平均菌落数计算1g、1ml或10cm2供试品中所含的微生物数。4.8薄膜过滤法：4.8.1采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不不不大于0.45μm，直径约为50mm。选择滤膜材质时应确保供试品及其溶剂不影响微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的办法灭菌。使用时，应确保滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充足干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量普通为100ml。每片滤膜的总过滤量不得超出1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。4.8.2取相称于每张滤膜含1g、lml或10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g、lml或10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液lml进行实验。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗办法和冲洗量同“计数办法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖培养基上，按照上述需氧菌总数和霉菌和酵母菌总数的检查办法进行检查。4.8.3阴性对照实验：取实验用的稀释液lml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。4.8.4培养和计数：培养条件和计数办法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超出100cfu。4.8.5菌数报告规则：以相称于1g、lml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品)，或<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。4.9控制菌检查（大肠埃希菌、沙门菌）：4.9.1供试品检查：供试品的控制菌检查应按经办法合用性实验确认的办法进行（验证办法详见《附录2》）。4.9.2大肠埃希菌的检查：取供试液10ml（相称于供试品1g、1ml、10cm2），直接或解决后接种至适量（不少于100ml）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。4.9.2.1选择和分离培养：4.9.2.1.1取麦康凯液体培养基3份，每份100ml，2份加入上述培养物1ml（相称于供试品1g、1ml、10cm2），另外1份加入供试液和对照菌不不不大于100cfu作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。42～44℃培养24～48小时。阳性对照实验应检出对应的控制菌，阴性对照应无菌生长。4.9.2.1.2取上述3份的培养物分别划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。4.9.2.2若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离，纯化及适宜的鉴定实验，确认与否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定成果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。4.9.2.3若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特性相符或疑似，应挑选2～3可疑菌落作靛基质实验（I）、甲基红实验（M）、乙酰甲基醇生成实验（V-P）、枸椽酸盐运用实验（C）及革兰染色、镜检，按下表规定判断成果。大肠埃希菌菌落形态特性:培养基菌落形态麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边沿整洁，表面光滑，湿润4.9.2.3.1靛基质实验（I）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养24小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。4.9.2.3.2甲基红实验（M）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时±2小时，于管内加入甲基红批示液数滴，立刻观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。4.9.2.3.3乙酰甲基甲醇生成实验（V-P）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时±2小时，于每2ml培养液中加入2-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml，充足振摇，出现红色为阳性，无红色反映为阴性。4.9.2.3.4枸椽酸盐运用实验（C）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸椽酸盐培养基的斜面上，普通培养48～72小时，培养斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无变化为阴性。4.9.3沙门菌的的检查：取供试品10g或10ml，直接或解决后接种至适宜体积的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。4.9.3.1选择和分离培养：4.9.3.1.1取上述培养物0.1ml，接种于10mlRV沙门菌增菌液体培养基中，30～35℃培养18～24小时后，取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48小时。4.9.3.1.2沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，或采用其它适宜办法进一步鉴定。4.9.3.2成果判断：若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底色为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定实验，确认与否为沙门菌。如果平板上没有菌种生长，或虽有菌种生长但鉴定成果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底色未见黄色，或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。附录1.需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数用培养基的合用性检查1.需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数：1.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数用培养基应进行培养基的合用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。1.2菌种：实验用菌株的传代次数不得超出5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以确保明验菌株的生物学特性。1.3菌液制备：1.3.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨琼脂斜面新鲜培养物一接种环，接种于胰酪大豆胨液体培养基中，在30～35℃培养18～24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每ml含菌数为不不不大于100cfu；1.3.2取白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂斜面新鲜培养物一接种环，接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，在20～25℃培养48～72小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每ml含菌数为不不不大于100cfu；1.3.3取黑曲霉接种沙氏葡萄糖琼脂斜面，在20～25℃培养5～7天，再取黑曲霉的新鲜培养物，加入5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后采用适宜的办法吸出胞子悬液（用管口带有薄的无菌棉花）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每ml含孢子数不不不大于100cfu的胞子悬液。1.3.4菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用；黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。1.4合用性检查：1.4.1取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各不不不大于100cfu，分别注入无菌平皿中，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，在30～35℃培养18～24小时，计数。1.4.2取白色念珠菌、黑曲霉各不不不大于100cfu，分别注入无菌平皿中，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，在20～25℃培养48～72小时，计数。1.4.3同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。1.5成果判断：被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范畴内。且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，被检液体培养基管与对照培养基管比较，实验菌应生长良好。判该培养基的合用性检查符合规定。1.6计数办法的验证：在建立产品的微生物程度检查法时，应进行需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数的验证，以确认所采用的办法合用于该产品需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的测定。若该产品的成分或原检查条件发生变化可能影响检查成果时，计数办法应重新验证。1.6.1菌种及菌液制备：同4.7.3项。1.6.2验证办法：验证明验最少应进行3次独立的平行实验，并分别计算各实验菌每次实验的回收率。1.6.2.1实验组：1.6.2.1.1取已制备好的供试液，加入实验菌液，混匀，使每1ml供试液中含菌量不不不大于100cfu。1.6.2.1.2然后用1ml无菌吸液管各精确吸取1.0ml1:10供试液至两个无菌平皿中，立刻倾注琼脂培养基，每株接种2个无菌平皿。按平皿法测定其菌数。1.6.2.2菌液组：1.6.2.2.1取稀释液替代供试液，按实验组操作加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各不不不大于100cfu，分别注入无菌平皿中，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，在30～35℃培养不超出3天，计数。1.6.2.2.2取黑曲霉不不不大于100cfu，分别注入无菌平皿中，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，在20～25℃培养不超出5天小时，计数。1.6.2.2.3取白色念珠菌不不不大于100cfu，注入无菌平皿中，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，在20～25℃培养48～72小时，计数。1.6.2.3供试品对照组：取制备好的供试液，已稀释液替代菌液，用1ml无菌吸液管各精确吸取1.0ml1:10供试液至平板中，同实验组操作。立刻倾注琼脂培养基，制备2个平板，按平皿法测定其菌数。1.6.2.4成果判断：计数办法合用性实验中，采用平皿法时，实验组菌数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范畴内。若各实验菌的回收实验均符合规定，照所用的供试液制备办法及技术办法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。验证明验也可与供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数同时进行。附录2.控制菌检查用培养基合用性检查：控制菌检查用的培养基应进行培养基的合用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。检查项目涉及培养基的促生长能力、批示特性和克制能力的检查。2.1菌种：对实验菌种的规定同计数培养基的合用性检查。2.1.1菌液制备：2.1.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基上中，在30～35℃培养18～24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每ml含菌数为不不不大于100cfu。2.1.1.2菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。2.1.1.3合用性检查：检查项目涉及培养基的促生长能力、批示特性和克制能力。各培养基的检测项目及所用菌株见下表。控制菌检查培养基特性实验菌株大肠埃希菌麦康凯液体培养基促生长能力大肠埃希菌麦康凯琼脂培养基促生长能力和批示特性大肠埃希菌沙门菌RV沙门菌增菌液体培养基克制能力金黄色葡萄球菌木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基促生长能力和批示特性乙型副伤寒沙门菌三糖铁琼脂培养基批示能力乙型副伤寒沙门菌2.1.2液体培养基的促生长能力检查：2.1.2.1RV沙门菌增菌液体培养基:分别接种4.9.1.3.1项下的乙型副伤寒沙门菌菌液，接种于