鸡球虫病新防控策略

鸡球虫病新防控策略

1鸡球虫病概况鸡虫病是由寄生虫引起的，即由艾美耳虫引起的。寄生于鸡肠道内的艾美耳球虫共有7个种,分别是柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、毒害艾美耳球虫(E.nectrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)和早熟艾美耳球虫(E.precox)。各种球虫在鸡消化道内寄生部位有所不同,柔嫩艾美耳球虫寄生于盲肠,堆型艾美耳球虫寄生于十二指肠,巨型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫寄生于小肠,布氏艾美耳球虫寄生于小肠下段和直肠。球虫在鸡体内的生活史较为复杂。具有感染性的孢子化卵囊经口感染鸡后,卵囊在胃中由于机械作用破碎后释出孢子囊,随后进入小肠的孢子囊则在胰蛋白酶和胆汁的共同作用下脱囊释放出子孢子。子孢子在小肠上皮细胞内经历裂殖生殖和配子生殖,形成卵囊排出体外。卵囊在外界适宜的温度、湿度和氧气的条件下完成孢子生殖再次形成感染性卵囊,从而进行下一轮感染。鸡球虫在田间广泛存在,凡有鸡的地方就有鸡球虫。鸡球虫病常见于规模化的商品养鸡场,给养禽业造成巨大的经济损失。全世界每年因球虫病以及防治球虫病的药物与疫苗费用支出达到了20亿英镑,我国每年仅抗球虫药即消耗约6~18亿人民币。根据世界各地的流行病学调查结果,田间最常见的球虫种为堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫。综合各种球虫的致病力和流行性,7种鸡球虫对养禽业的危害从大到小依次为柔嫩、堆型、巨型、毒害、布氏、和缓和早熟艾美耳球虫。球虫病在田间流行而一直不能被彻底清除的原因主要有2个:首先,球虫卵囊具有厚厚的外壁,这个外壁为卵囊在恶劣的环境中存活提供强大的保护,多种去污剂都不可以将其灭活,甚至有文献记录提到固定染色处理过的组织切片中的卵囊仍然可以进行发育;另外,球虫异常强大的繁殖力为其后代的大量存在提供了数量保障,以柔嫩艾美耳球虫为例,感染一个卵囊可以最终产生多达80万个后代卵囊(另有文献为150万个)。2球虫病理变化的鸡组织协调鸡球虫的致病性跟宿主和虫体二者的关系是密不可分的。首先,不同的虫种的致病性有差异。感染毒害艾美耳球虫的病理变化是最严重的,临床症状明显的鸡只剖检时可见小肠粘膜出现大量粟米粒大小的出血斑与灰白色坏死灶,小肠大量出血并有大量干酪样坏死物残留,小肠高度肿胀且明显变得比正常小肠短。柔嫩艾美耳球虫则引起急性的盲肠球虫病,其症状表现为感染后5~6d时鸡排出大量血便,感染严重者死亡。剖检可见盲肠高度肿胀、肠壁变薄,内有大量血液留存,后期则为凝血块或硬质的盲肠芯。总的说来,7种艾美耳球虫都能大量破坏肠道上皮细胞,使肠粘膜失去完整性,从而引发消化和吸收机能紊乱;肠道内残留的各种血液成分、死亡虫体等产生许多毒性物质,机体吸收后可致自体中毒。造成临床或亚临床病理变化的主要原因是球虫在细胞内的裂殖生殖和配子生殖过程中,大量繁殖的裂殖体释放子代裂殖子或者是大量配子体细胞的形成,造成肠上皮细胞的破坏,从而引发如上病变。宿主方面的因素对球虫致病性的影响也是很大的,包括鸡的品种、日龄、营养状况和免疫状况等。Joyner和Norton发现2万个柔嫩艾美耳球虫卵囊即造成大量白来航鸡发病死亡,而Williams却发现即使是9.8万个柔嫩艾美耳球虫卵囊都不会造成洛岛红×洛克杂交鸡的死亡。雏鸡对球虫更易感,更容易表现出球虫病临床症状;耐过的雏鸡在后期生长中会有较好的恢复,但其生长潜能大打折扣。鸡群的群体免疫状况直接影响着群体对球虫的易感性。一般说来,营养状况良好的鸡只抗球虫病的能力较强。鸡的日龄增大时其免疫系统也发育得更完善,故而比新生雏鸡的抵抗力强。当鸡的免疫器官受到损害,尤其是体内的大部分T淋巴细胞失去功能时则会导致鸡对球虫的易感性大大增强。艾美耳球虫各个种都可以激发感染后的鸡只产生长久的特异性免疫保护力,不过这种免疫保护仅仅针对先前感染过的同一虫种。Rose和Long发现,首次用500个卵囊感染后,一周后再次用5000个卵囊感染可以使鸡只产生针对柔嫩艾美耳球虫的保护性免疫力。在这个研究中,他们还发现4种球虫的免疫原性从强到弱依次为堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫。一个有趣的现象是仅需感染少量的巨型艾美耳球虫卵囊即可产生良好的免疫保护,而且这种保护性还具有不同分离株的特异性——其他虫种则尚未发现有此种情况发生。艾美耳球虫的生活史较为复杂,其体内发育经历多次的细胞入侵过程。但研究者对发育中各阶段虫体的免疫原性强弱的看法有很多的不一致。Rose等人认为柔嫩艾美耳球虫的早期内生阶段较之后期的有性生殖阶段更具免疫原性。近来Wallach等人研究认为巨型艾美耳球虫配子体细胞也具有免疫原性,可以诱导产生针对攻虫感染的免疫保护。Lillehoj和Choi发现,重组的鸡γ-干扰素在体外可以阻滞球虫的细胞内发育过程,从而认为宿主产生的免疫保护是针对球虫生活史中的暴露阶段。尽管现在寄生虫学界达成了免疫预防应尽快取代球虫药在球虫病控制领域占主导地位的共识,不过由于宿主与球虫间相互作用的复杂性,鸡球虫的免疫原性的揭示还有待于更深入的研究。3细胞免疫和局部感染鸡在长期的进化过程中形成了一套完整而复杂的免疫系统,而且与哺乳动物的免疫系统有着很多相似的地方。鸡的先天性免疫机制在病原入侵后立刻发生效应,通过巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和可溶性因子而发挥第一道防线作用。而获得性免疫则在先天免疫激活下通过淋巴细胞及其分泌的因子如抗体、细胞因子来产生特异性的记忆性免疫应答。肠道的黏膜相关淋巴组织是鸡产生抗球虫感染免疫应答的场所。肠黏膜的非特异性屏障在抗球虫感染中的作用机制也许与抵抗其他病原体的感染有相似之处,但不甚明了。大量的淋巴器官和细胞参与抗球虫感染的特异性免疫应答,通过抗体和淋巴细胞的介导发挥作用。鸡感染球虫后,相对于其他部位,球虫感染的肠道上皮部位产生的IgA和IgG明显增多。然而,抗体在抗球虫感染中起的作用是很有限的。IgA可能与虫体表面结合而阻止球虫与宿主细胞表面的结合,或者是降低虫体的移行性。通常认为,在抗球虫感染中,抗体介导的体液免疫起次要作用。细胞免疫才是主导。Lillehoj发现法氏囊功能的丧失并不影响抗球虫免疫保护的产生,这给了细胞免疫主导学说提供了有力证据。Smith和Hayday利用感染了E.vermiformis的基因工程小鼠做了大量关于球虫感染后机体产生免疫应答的研究。结果证明,产生IFN-γ的TCRγσCD4+T细胞在初次感染和再次感染的应答中都是必须的。Trout和Lillehoj通过实验证明,在针对柔嫩艾美耳球虫初次感染的免疫应答中,CD4+T细胞是重要的效应细胞;同时他们还发现,缺失CD8+T细胞的鸡在再次感染同种球虫后,卵囊排出明显增多,这表明CD8+T细胞是二次感染或多次感染的免疫效应细胞。从上面可以发现,CD8+T细胞在艾美耳球虫感染免疫进程中有着双重作用:在初次感染的子孢子入侵过程中,其起着转运细胞的作用;而在再次感染应答中,其为效应性细胞。鸡肠道黏膜中的巨噬细胞也有着双功能性,其在活化后可以产生活性氧和活性氮中间产物,这些因子能有效杀伤入侵的寄生虫。在不同实验中,研究者也观察到了NK细胞和肥大细胞参与球虫与宿主间免疫反应。Cheung等人观察到,在初次感染的早期阶段,NK细胞的数目增多,而且其在体外实验中具有自然杀伤活性。细胞因子的作为重要的治疗制剂和免疫佐剂成为了近年来的研究热点。有研究表明,用重组表达的鸡IFN-γ治疗感染球虫的鸡,可以提高其增重。用小剂量的球虫多次感染鸡只,可以获得明显好于一次大剂量感染所产生的免疫力,基于此实验现象,Joyner和Norton在20世纪70年代提出了涓滴感染效应理论,这成为了利用活卵囊疫苗预防田间球虫病的基础理论。随后,有许多研究者证实和完善了这一理论。Williams系统地阐述了商品生产鸡的群体免疫力的产生机制。鸡在接种活卵囊疫苗后,疫苗虫株在宿主体内完成其第一个生活周期。此过程中,能刺激机体产生初次免疫应答。随粪便排出的卵囊可以再次感染鸡,而且鸡也可以摄取垫料中的田间卵囊。这样卵囊对鸡只的感染出现了时间上的不一致性,形成了轻度的持续重复感染。由于每次感染的卵囊数量较少,这种持续性感染不会引起鸡只发生球虫病,而是使鸡只从不断的再次应答中获得逐渐升高的免疫保护力。4抗球虫药的使用自20世纪40年代发现磺胺类药物具有抗球虫作用以来,先后有50多种的抗球虫药应用于鸡球虫病的防治。不过随着球虫耐药性的产生、药物的功效和药物毒性等多种因素的影响,多数药物已经退出市场。养禽业现在仍在使用的抗球虫药有20多种,这其中市场份额最大的抗球虫药是聚醚类离子载体药物,如莫能霉素、拉沙霉素、马杜拉霉素、那拉霉素和盐霉素;另一类应用也较为广泛的为化学合成的抗球虫药,如氨丙啉、常山酮和地克珠利。抗球虫药多添加于饲料中使用,少数则通过饮水给予。抗球虫药的使用策略主要有以下几种:①连续用药,即饲料中不间断地添加药物直至休药期;②间断用药,即每隔5~7d的用药后停药2~3d,如此重复;③轮换用药,即连续养殖过程中,每隔一定时间(从3个月到几年)更换一种抗球虫药;④穿梭用药,即同一饲养周期内更换使用2~3种的抗球虫药物;⑤联合用药,即同时使用2种或以上的抗球虫药物。在生产中,需要根据实际情况来选择应用上述方案。如在饲养周期短的肉仔鸡中,常用连续给药、穿梭给药或轮换用药;而后备鸡群主要通过预防性地给予药物——药物药效是二元性的,既可以预防球虫病爆发,又可以使鸡群获得并维持低水平的球虫感染,从而产生一定的抗球虫免疫保护力。另外,抗球虫药的使用还要遵循“预防为主,防重于治”的原则,亦即药物预防的效果总好于药物治疗。从种类繁多的抗球虫药物中进行选择时,要注意到药物的抗虫谱、残留、配伍和用量等多方面的因素,从而达到合理有效的防治预期。5抗原性的虫系活卵囊疫苗经历了50多年的发展过程,到目前为止,有不下10种商业化的活卵囊疫苗在全球推广应用。这其中应用最为广泛的主要有Paracox®、Coccivax®、Immucox®和Livacox®这4种活卵囊疫苗及其衍生品种。过去活卵囊疫苗主要应用于蛋鸡群,随着疫苗投放方式的改进,如以喷雾或饮水对1日龄雏鸡进行免疫,使得活卵囊疫苗的应用逐渐从产蛋鸡推广到了大规模的肉仔鸡生产中。不同的活卵囊疫苗的主要区别在于疫苗组分中的艾美耳球虫虫株及其毒力。现在的活卵囊疫苗都含有2~5种甚至是所有种的鸡球虫。所有的活卵囊疫苗都含有堆型、巨型和柔嫩这3种艾美耳球虫种的虫株,而如Paracox®甚至还含有巨型艾美耳球虫2种不同抗原性的虫系。疫苗虫株一类为田间分离或实验室培养得到的强毒株,使用强毒株的疫苗包括Coccivax®、Immucox®和VACM®等,其中VACM®仅使用了离子载体药物耐药性的巨型艾美耳球虫虫株;而另一类则是经过早熟选育或鸡胚传虫代选育而得到的致弱株,由致弱虫株组成的疫苗有Paracox®、Livacox®。活卵囊疫苗的免疫方式从最初的饮水或饲料投放发展到现在有了更多的方法可供生产者选择,这是活卵囊疫苗逐步得到广泛推广的一个重要原因。饮水给予疫苗可以通过饮水器或更先进的管道饮水系统实现,但由于球虫卵囊比重大于水,必须在饮水中添加合适的悬浮剂。滴眼的方法现在较少采用,尽管这种方法可以保证接种剂量的均一性。近来孵化室的喷雾免疫方式在肉仔鸡的生产中得到了大规模的应用。通过置于孵化室上方的喷淋装置将活卵囊疫苗喷洒刚出壳的雏鸡,这样鸡通过自梳羽毛或啄食同伴羽毛而食入疫苗卵囊。将疫苗卵囊包裹在可食凝胶中让雏鸡啄食也能达到较好的效果。Dibner等人发明了可直接经种蛋接种疫苗卵囊至卵黄囊的装置,不过有待于实现自动化以减轻接种的工作强度。活卵囊疫苗接种后,经过2到3周激发鸡群产生较好的针对田间球虫感染的保护性免疫,而这个时期往往是球虫病爆发的高峰期,因此可以达到较好的抗球虫效果。由于蛋鸡和后备鸡群饲养周期长,必须获得抗球虫免疫,所以早期的活卵囊疫苗这些类型的鸡群里使用较多。如前所述,针对肉仔鸡的饲养周期短的特点研发的活卵囊疫苗Paracox®-5和Livacox®Q等就是通过1日龄接种甚至是胚胎期接种来达到尽早产生免疫保护的目的。使用活卵囊疫苗的一个明显优势在于其不会产生抗药性和药物残留的问题。而且在球虫耐药性问题严重的养殖地区可以通过活卵囊疫苗的使用而逐步恢复田间鸡球虫对离子载体药物的敏感性。其机理可能是在不使用药物的情况下,活卵囊疫苗中的药物敏感株大量增殖而逐渐稀释了本来较小的耐药田间种群。近来开发的Nobilis®COMATM应用了耐药的田间分离虫株,可以在使用疫苗的同时给予离子载体药物,这也能达到传统活卵囊疫苗类似的效果。那么,结合抗球虫药物和活卵囊疫苗的轮换使用或联合应用,可以降低控制鸡球虫病的花费。6重组病毒疫苗随着基因工程的兴起,过去的10多年里许多研究者将更多的目光投向了重组疫苗的研究。研究者们希望利用重组表达的鸡球虫特定生活阶段的抗原来研制抗球虫的亚单位疫苗,后来的实验证明这只是一种良好的愿望。尽管离商业化应用还有很长的路要走,以DNA疫苗和蛋白疫苗为主的新型疫苗的开发随着相关分子生物学和免疫学理基础与技术的更新发展很是迅速。自Wolff等人发现裸DNA可以在肌细胞内表达以来,研究者也开始了DNA疫苗在球虫病治疗方面的探索。Kopko等人将编码折光体蛋白SO7构建到真核表达载体上,肌肉内注射免疫后用柔嫩艾美耳球虫感染,结果发现DNA疫苗有明显的减轻盲肠病变和阻止体重下降的作用。Song等人将表达堆型艾美耳球虫子孢子表面抗原3-1E的真核表达质粒pMP13给鸡肌肉内或皮下注射,用堆型艾美耳球虫感染10d后,鸡只血清抗体水平有明显升高,免疫后的T细胞亚群组成也有明显的改变,表明此DNA疫苗可以激发机体产生针对堆型艾美耳球虫的局部和系统免疫应答。随后Min等人用多种含有鸡细胞因子基因(IFN-γ、IL-8、IL-15、IL-1β和TGF-β4)的真核表达载体分别与pcDNA3-1E共同免疫后,攻虫感染的实验组鸡卵囊排出量明显减少,表明细胞因子佐剂的类型和剂量对DNA疫苗产生局部或系统免疫保护是有很大影响。亚单位疫苗则是直接利用重组表达的鸡球虫抗原蛋白。鉴定出鸡球虫在某一生活阶段与宿主免疫相关的特异性抗原之后,可以用此抗原蛋白免疫鸡只,从而激发机体产生抗球虫免疫。现阶段研究的重点候选疫苗抗原集中于鸡球虫发育过程中的虫体表面蛋白,如子孢子、裂殖子和配子体表面与入侵细胞有关的蛋白分子。重组的堆型艾美耳球虫cMZ-8、MA1、3-1E和Ea1A抗原以及柔嫩艾美耳球虫的GX3262和SZ-1抗原都可以激发宿主产生抗体应答,甚至是诱导宿主产生细胞免疫应答,证明了这些重组抗原可以激发宿主产生部分的抗球虫保护作用[36,37,38,39,40,41]。Belli等人发现重组的巨型艾美耳球虫配子体抗原gam56和gam82免疫鸡只后针对堆型、巨型以及柔嫩艾美耳球虫感染产生部分保护力,而基于此的亚单位疫苗CoxAbic®也已经开始了田间应用。利用DNA疫苗进行初次免疫,再用亚单位疫苗加强免疫可以获得优于前者单独免疫的效果。在伊氏锥虫的免疫实验中,获得了类似的实验结果,那么在抗球虫免疫方面这种DNA疫苗初免/蛋白质加强免疫的策略值得我们深入研究。利用病毒和细菌作为输送载体开发抗球虫疫苗的尝试在最近已有文献报道。Cronenberg等人用表达融合Ea1A蛋白的重组火鸡单纯疱疹病毒(HVT)免疫鸡只,大剂量的攻毒感染后发现免疫鸡群的体重明显高于感染对照。Du等将转染了带有柔嫩艾美耳球虫抗原基因质粒的弱毒沙门氏菌经口免疫后获得了较明显的保护效果。利用微生物载体将成为抗球虫疫苗开发的一条新途径。7球虫在新型疫苗中的作用基于预防鸡球虫病的活卵囊疫苗的广泛使用和分子生物学的飞跃发展,我们的研究小组正在利用鸡球虫建立一个转基因系统——即将具有良好免疫原性的病毒基因整合到弱毒的鸡球虫早熟株(系)基因组中(可以用7个种的鸡球虫中分别建立表达不同病毒抗原蛋白基因的转基因球虫),得到一个或多个能稳定表达外源病毒基因的转基因球虫系。该系统的建立可能预示着一种新型疫苗的诞生,即活疫苗(活球虫卵囊)为载体表达另外一个或数个(类)疫苗用抗原,同时激发细胞免疫和体液免疫(包括粘膜免疫)的新型疫苗生产体系。转基