毛果杨NADP-苹果酸酶基因家族分析

毛果杨NADP-苹果酸酶基因家族分析

根据nad或nad的不同，nad-me分为nad-me和nad-me。ec1。1.39，nad-me；ec1。1.40）（artus和appellee1985；anderson和andreo1992）。NADP-ME在二价金属离子存在下催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸、CO2和NADPH,是生物体内苹果酸代谢的关键酶之一(Edwards和Andreo1992)。根据行使功能的不同,植物的NADP-ME分为光合型和非光合型(Drincovich等2001)。光合型NADP-ME定位在C4植物维管束鞘细胞叶绿体(bundlesheathchloroplast)或景天酸代谢(crassulaceanacidmetabolism,CAM)植物的细胞质中,它催化苹果酸氧化脱羧生成的CO2用于Rubisco酶的光合碳固定,并且光合型NADP-ME基因表达被光照显著地诱导(Honda等2000;Rothemel和Nelson1989)。过量表达玉米光合型NADP-ME改变了转基因烟草气孔导度(stomatalconductance),提高转基因植株对水分的利用效率(Laporte等2002)。非光合型NADP-ME普遍存在于C3、C4和CAM植物中,根据其在细胞质或质体的不同定位分为质体型和细胞质型。它们参与植物的多种生理功能,包括调节细胞内pH、促进果实成熟及参与脂肪酸合成等(Davies1986;Edwards和Andreo1992;Martinoia和Rentsch1994;Drincovich等2001;Shearer等2004)。最近,一些研究报道非光合型NADP-ME参与植物对创伤、病原体侵袭、UV-B辐射等多种逆境因子导致的防御反应(Schaaf等1995;Pinto等1999;Casati等1999)。另外,非光合型NADP-ME在植物适应高盐、高渗透环境逆境中也起重要作用(Liu等2007;Cheng和Long2007)。因此,NADP-ME是植物体内一个重要的代谢酶,参与植物的多种生理功能。NADP-ME在高等植物中的编码基因是一个小基因家族(smallgenefamily)。研究表明,C4植物玉米中存在1个光合型、1个质体型和1个细胞质型NADP-ME(Detarsio等2008)。Honda等(2000)用Western分析技术从CAM植物芦荟中检测到3个NADP-ME同工酶。全基因组信息分析显示,C3植物拟南芥、水稻NADP-ME基因均是1个质体型、3个细胞质型(Wheeler等2005;Chi等2004)。另外,还有一些植物的NADP-ME基因家族的部分基因被克隆(Fu等2009;Muller等2008;Casati等1999;Cushman等1992)。然而,人们对树木中NADP-ME基因信息及其功能了解甚少。本文以全基因组信息已解读的毛果杨为对象,从基因组水平鉴定和分析毛果杨NADP-ME(PtNADP-ME)基因家族,并探讨高盐、渗透胁迫几种环境逆境下毛果杨PtNADP-ME家族基因表达的情况。这些工作为研究树木NADP-ME家族的生理功能提供基础信息。材料和方法1无菌苗栽培处理毛果杨(PopulustrichocarpaTorr.&Gray)无菌苗由中国科学院上海生命科学研究院李来庚博士赠与,无菌苗的组培扩繁按照Kang等(2009)方法进行。选用同一批株高基本相同的组培无菌苗,种植于装有土壤基质的16cm营养钵中,置于人工气候室中培养。培养条件为:24~28℃,光照强度150μmol·m-2·s-1,光周期16/8h,相对湿度60%。每5d浇1次Hoagland营养液,生长至90d时,分别取幼苗的各种组织器官。另外,逆境处理用200mmol·L-1NaCl、300mmol·L-1甘露醇和8%PEG8000溶液分别浇灌盆栽幼苗,对照组用水浇灌。每种逆境处理3盆幼苗,每盆幼苗浇灌500mL的处理溶液,处理时间分6和12h两种。处理后收集毛果杨材料,液氮速冻后用于总RNA的分离。2方法2.1从ptnad-me家族基因获得的基因2.2ptnadp-me家族蛋白氨基酸序列比对和无根进化树用毛果杨基因组数据库中NADP-ME家族基因编码区序列(CDS)和对应的全基因组序列在GeneStructureDisplayServer(http://gsds.cbi.pku)中绘出基因结构图。利用ClustalW(http:/align.genome.jp)对获得的5个PtNADP-ME家族蛋白氨基酸序列进行同源序列比对,参数为默认。用BioEdit生物学软件分析其保守或相似的氨基酸序列。以序列比对的结果为基础,利用MEGA4软件进行进化树校验,生成NADP-ME家族蛋白的无根进化树。进化树生成用邻接法(neighbor-joining)由1000次自举值(bootstrap)重复抽样组成。2.3毛果杨材料总rna的分离用pBiozolPlantTotalRNA试剂(博日科技公司)分离各种毛果杨材料的总RNA,具体步骤按照其说明书操作。总cDNA的合成使用PrimeScripRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒(TaKaRa公司)。2.4dna测序鉴定合成的cDNA用于PtNADP-ME家族各基因CDS的DNA片段扩增,所用基因的引物如表1所示。扩增产物回收后连接到载体pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen公司)上,进行DNA测序鉴定。半定量RT-PCR时,以相同量总RNA(1μg)合成cDNA,合成的cDNA稀释5倍后作为模板,以毛果杨Actin2基因作为内标进行半定量RT-PCR,所用各基因的引物如表1所示。结果与讨论1nadp-me基因在纳米火炬中的生长与拟南芥NADP-ME同源性程度较高的蛋白有5个,它们的基因名称、蛋白ID、推测氨基酸长度如表2中所列,属于NADP-ME基因家族,分别命名为PtNADP-ME1、2、3、4、5,这显示C3木本植物毛果杨基因组中存在5个NADP-ME基因。根据一些已知全基因组信息的植物物种及其相关文献表明,C4植物玉米中存在3个NADP-ME,CAM植物芦荟中被检测到3个NADP-ME同工酶,C3草本植物拟南芥、水稻的NADP-ME基因均是4个(Detarsio等2008;Wheeler等2005;Chi等2004;Honda等2000)。这暗示树木NADP-ME家族成员及其生理功能可能复杂于草本植物的NADP-ME。另外,由于杨树基因组测序片段被组装成22136个骨架(scaffold),共计473.1Mbp,其中143个骨架已定位到遗传图谱上(Tuskan等2006),可以把一些基因定位到相应的染色体位置上。我们检索分析毛果杨NADP-ME家族5个基因在染色体上的定位分布结果显示5个PtNADP-ME基因分布在第18、6、18、1及3条染色体上(表2)。2ptnadp-me4基因的转录用GeneStructureDisplayServer软件绘出毛果杨、拟南芥及水稻NADP-ME家族基因的结构图。毛果杨NADP-ME家族4个基因PtNADP-ME1、2、3、5的外显子数目分别为18、18、18和19(图1)。然而,PtNADP-ME4在毛果杨基因组数据库中其基因的转录本没有检索到起始密码子,这可能是毛果杨基因组数据库的信息错误所致。因此,我们在Softberry服务器上用FGENESH程序重新预测PtNADP-ME4,得到PtNADP-ME4新的基因结构(图1)。原毛果杨基因组数据库中PtNADP-ME4基因的预测少了两小节外显子,在图1中用星号标出其推测氨基酸长度由原数据库中的595增长至649。拟南芥NADP-ME家族4个基因AtNADP-ME1、2、3、4的外显子数目均为18,水稻的3个NADP-ME基因的外显子数目都在18~20之间(图1)。这些结果显示,毛果杨、拟南芥及水稻3个物种的NADP-ME基因的结构是类似的,原因可能与它们在进化上的保守程度是分不开的。3毛果杨ptnadp-me系统发育学研究设计基因的特异引物(表1),通过RT-PCR扩增PtNADP-ME1、2、3、4和5基因的CDS。将这些片段分别连到pENTR/SD/D-TOPO载体上,得到重组质粒,DNA测序显示重组质粒中插入片段与理论预测的PtNADP-ME基因CDS完全一致。这些结果表明,上述毛果杨NADP-ME家族5个基因的结构分析及我们对毛果杨数据库中PtNADP-ME4基因结构的重新预测都是正确的。分析PtNADP-ME家族推测氨基酸的同源性、保守区域及进化关系显示,PtNADP-ME1、2、3、4和5任意两个成员之间的推测氨基酸序列一致性均大于64%(图2),同源性最高的PtNADP-ME2和PtNADP-ME3氨基酸序列一致性高达91%(资料未列出)。另外,氨基酸序列一致性比对还显示,毛果杨PtNADP-ME家族每个成员均有NADP-ME保守的5个氨基酸区域(图2)。这5个保守的氨基酸区域是植物体中NADP-ME蛋白典型的特征,其中氨基酸保守区域I、II、V是NADP的结合区域,但III和IV的功能尚不清楚(Fu等2009;Chi等2004;Chang和Tong2003;Drincovich等2001)。结合单子叶水稻和双子叶拟南芥NADP-ME家族所有成员,我们分析毛果杨NADP-ME家族成员的进化位置。构建的进化树显示,进化分枝分为4组(图3):(1)双子叶植物细胞质NADP-ME型(标注菱形),包括毛果杨PtNADP-ME2、PtNADP-ME3和拟南芥AtNADP-ME2、AtNADP-ME3;(2)双子叶植物质体NADP-ME型(标注正三角形),包括毛果杨PtNADP-ME4、PtNADP-ME5及拟南芥AtNADP-ME4;(3)单子叶植物NADP-ME型,仅有3个水稻NADP-ME(标注圆形);(4)NADP-ME其他类型(标注倒三角形)。另外一些研究报道,植物的NADP-ME从系统进化关系上分为4组:双子叶植物细胞质NADP-ME型、双子叶植物质体NADP-ME型、单子叶植物NADP-ME型及其他类型NA-DP-ME(Wheeler等2005;Drincovich等2001)。我们的结果表明,木本植物毛果杨NADP-ME家族成员所处的进化分枝仍符合植物NADP-ME进化关系。另外,构建的进化树显示毛果杨基因组中质体型NADP-ME有2个成员,而同为双子叶草本植物拟南芥和烟草都只有1个质体NADP-ME(Muller等2008;Wheeler等2005)。这可能是木本植物NADP-ME家族不同于草本植物的差别所在。4成熟叶中ptnadp-me2和ptnadp-me3的转录水平以Actin2内标基因作为对照,用半定量RT-PCR分析毛果杨PtNADP-ME基因家族在叶、顶芽、幼茎(未木质化)、老茎(木质化)、木质部等组织中的表达水平。结果显示,PtNADP-ME1、4、5的转录表达模式相似,除PtNADP-ME5在成熟叶中转录水平稍低,在本实验所选的其余组织中这3个基因转录水平均较高,无明显的特异性表达器官PtNADP-ME2和PtNADP-ME3的表达模式也较类似,在顶芽和成熟叶中表达量相对较高(图4)。这些结果表明,PtNADP-ME基因家族没有明显的组织特异表达模式,且表达上存在明显的冗余。旺盛次生生长形成的木材是树木重要的生物学性状也是树木体内碳水化合物合成、运输、再分配的结果。NADP-ME是C4、CAM植物碳固定和碳水化合物代谢的一个重要酶(Drincovich等2001)。然而在C3植物毛果杨的顶芽、幼茎、老茎、木质部等与木材形成相关的组织中,NADP-ME基因表达均未显示显著的差异表达或与其木质化程度同步表达。这暗示NADP-ME在C3木本植物中可能不参加碳的固定或不直接参与树木木材形成的生理活动,而是存在其他方面的功能。5对pacl、peg、甘露醇的转录表达用半定量PCR方法分析NaCl、甘露醇和PEG不同逆境胁迫下PtNADP-ME基因表达变化,结果如图5所示。PtNADP-ME1的表达轻微地受NaCl盐诱导,但甘露醇和PEG渗透处理均持续地诱导其表达。在NaCl盐胁迫下PtNADP-ME2的转录水平先升后降,甘露醇处理没有改变其表达,而PEG处理显著下调其表达。PtNADP-ME3在NaCl胁迫下转录表达先升高后恢复到对照水平,甘露醇处理诱导其转录表达。质体型PNADP-ME4和PtNADP-ME5的转录表达均显著地被NaCl、PEG及甘露醇3种不同处理所诱导:在NaCl处理下二者的mRNA水平持续诱导升高;而在甘露醇胁迫下随着处理时间延长二者转录水平均有所下降,但仍比对照的增加数倍;PEG处理时二者转录表达均先显著升高后恢复到对照水平。这些结果显示,毛果杨PtNADP-ME家族基因的表达受高盐、高渗透逆境胁迫所诱导,