匹鲁卡品与戊四氮阻燃模型大鼠行为学及组织学改变比较

匹鲁卡品与戊四氮阻燃模型大鼠行为学及组织学改变比较

癫痫动物模型在癫痫的病因、发病机制和药理学研究中发挥着重要作用。神经元丢失及苔藓纤维出芽是癫痫产生过程中较常见的组织病理学变化。匹鲁卡品(毛果芸香碱)致癫模型及戊四氮点燃模型均是临床常用的新生鼠癫痫动物模型,两种模型各有不同特点,采用不同的模型可能会有不同的试验结果。目前的试验研究大都选择单一致癫模型,缺少对两种模型癫痫发作过程的对比性研究,本研究分别制作两种癫痫模型,同步观察两种模型不同的行为学特征和组织学改变,并探讨神经元丢失及苔藓纤维出芽在癫痫发病中改变情况。1水合氯醛单次注射致癫痫模型1.1实验动物与试剂实验动物为烟台绿叶制药公司动物中心提供,生后1d的SD大鼠60只,随机分为盐水对照组、匹鲁卡品组、戊四氮组,每组20只,分别标记并与母鼠同笼喂养。匹鲁卡品、东莨菪碱、戊四氮均为Sigma公司产品。1.2癫痫模型的制作匹鲁卡品组:先予东莨菪碱1mg/kg腹腔注射,以拮抗外周胆碱能反应,30min后腹腔注射10%匹鲁卡品350mg/kg,若注射匹鲁卡品后30min无惊厥发作,再按每次10mg/kg追加匹鲁卡品。若惊厥发作持续30min仍未停止,则给予水合氯醛400mg/kg腹腔注射,及时中止发作。戊四氮组:首次腹腔注射惊厥阈下剂量戊四氮40mg/kg,10min后注射20mg/kg,以后每10分钟注射10mg/kg,直至出现6、7级抽搐发作。急性期诱发发作后,每天早7点到晚8点逐只观察动物有无自发性发作及动物的死亡情况。对照组:给予生理盐水腹腔注射。1.3Lado幼鼠癫痫发作分级标准0级:无发作;1级:机械性咀嚼;2级:连续性点头;3级:单侧前肢阵挛;3.5级:前肢交替阵挛;4级:双侧前肢阵挛、后退;5级:双侧前肢阵挛、后退、摔倒;6级:狂奔嘶叫;7级:强直发作。1.4病理学研究将致痫并存活的各组新生大鼠分别于模型成功制作后1d及45d给予水合氯醛腹腔麻醉,灌流固定取脑,在海马部位做冠状连续冰冻切片,切片厚度20μm,每隔1张取片,分别行Nissl染色。首先入二甲苯,然后依次入100%、95%、85%、70%、50%的梯度酒精,蒸馏水浸洗,入1%的甲苯胺蓝染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。1.5苔藓纤维发芽检测取已经切好的冰冻切片于黑暗处Timm染色液中孵育,取出切片后冲洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,玻片覆盖。半定量评分,评分标准按苔藓纤维发芽量表进行。1.6统计学处理实验结果以x¯±sx¯±s表示,应用SPSS11.5软件进行统计学处理,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1实验结果及分析匹鲁卡品组,匹鲁卡品的剂量为370~390mg/kg,诱发出现发作的平均时间为(13.2±2.6)min,动物呈现凝视、机械性咀嚼、连续性点头及肌阵挛,无全身强直阵挛发作,发作持续时间在5~20min。随着注射次数的增加,诱导惊厥发作的潜伏期缩短,匹鲁卡品所需剂量渐小,而发作等级发作程度逐渐增强。停止注射1周后,无再次诱发情况下未观察到4级以上自发发作。戊四氮组首次应用戊四氮40mg/kg后,均在1~2min出现全身抖动,躯体游走性痉挛,臀部上翘等表现。重复注射,动物很快出现兴奋性极度增高,狂奔、嘶叫、角弓反张,随即出现全身强直,末梢皮肤发绀,3~10s后出现节律性肢体阵挛抽动,逐渐肌肉松弛,抽动减少至停止,整个过程持续5~60min。部分新生鼠发作停止数分钟后又再次发作,如此反复数次。对照组无发作。2.2齿状回颗细胞层结构不同实验组在1d及45d分别进行Nissl染色,观察海马各区锥体细胞层及齿状回门区神经元细胞的丢失情况。研究显示,同一组不同时点相同区域神经元计数无差异,两个致癫模型组及对照组CA3区、CA1区及齿状回颗粒细胞层分别见大量致密的锥体细胞及颗粒细胞,门区有中等量神经元,排列整齐,形态完整,胞浆内尼氏小体丰富,神经元呈蓝色,而背底几乎无色。与对照组比较,戊四氮组与匹鲁卡品组海马及齿状回未见明显神经元形态学改变和神经元丢失。2.3轴突苔藓纤维入门区模型制备完成后,不同组齿状回内分子层苔藓纤维出芽的比较发现,两组均可见齿状回颗粒细胞的轴突(苔藓纤维)进入门区,形成一致密的纤维带紧邻CA3锥体细胞层走行,结束于透明层。根据苔藓纤维发芽评分标准,戊四氮组CA3区Timm评分(1.56±0.08)明显高于匹鲁卡品组评分(0.55±0.09),差异有高度统计学意义(P<0.01)。3苔藓纤维发芽是大鼠致痫后的景观指标啮齿动物如同人类一样,不同年龄阶段的神经系统发育情况不同,在研究动物癫痫或惊厥发作模型时必须考虑年龄或日龄因素。有统计资料显示儿童时期惊厥的发生率较一般人群高5~10倍,尤以1岁以内婴儿最高,同时临床实践表明,小儿惊厥的发生发展过程包括惊厥的行为特征、脑电图变化及惊厥预后等均与成人明显不同,癫痫持续状态的发生率远远高于成人。戊四氮癫痫持续状态模型及匹鲁卡品点燃模型是常用的新生鼠癫痫模型,两种模型有不同的特点。本研究同步观察了两种模型不同的行为学特征、癫痫模产生过程中神经元的丢失,及苔藓纤维出芽的动态变化。结果显示,匹鲁卡品组大鼠通过反复注射,80%左右的大鼠能够成功点燃,出现3次以上6或7级发作,但20%大鼠出现耐受现象,未出现6或7级发作,停止注射1周后,无再次诱发情况下未观察到4级以上自发发作。戊四氮组首次应用阈下剂量注射,大鼠即迅速出现4级以上发作表现,重复注射后,90%左右的大鼠能够成功点燃,但10%大鼠出现耐受现象,不出现6或7级发作。本实验观察新生大鼠戊四氮反复惊厥1d和45d模型的海马神经元形态,未发现神经元明显凋亡、坏死现象,与匹鲁卡品以及对照组相比无明显差异,神经细胞计数CA1、CA3及门区与对照组也无明显差异,该结果与Planas等的研究相吻合。苔藓纤维发芽是成熟期癫动物模型中普遍存在的现象。本实验中,两个实验组新生鼠点燃后均可以观察到苔藓纤维发芽,根据苔藓纤维发芽评分标准戊四氮组CA3区Timm评分明显高于匹鲁卡品组,差异有高度统计学意义,该结果提示成熟脑和未成熟脑癫痫模型都经历这一病理性改变,表明苔藓纤维发芽的确是癫痫病理生理过程中的重要变化。但癫性发作是否由苔藓纤维发芽所致的突触重组引起,目前尚无明确证据。综合以上指标可以发现,新生