福建蛋白山核桃病菌的菌种分离与鉴定

福建蛋白山核桃病菌的菌种分离与鉴定

优果坚果种植是优果县的主要产业之一，也是当地农民增加收入和富裕的主要形式之一。近年来随着漾濞核桃种植规模的扩大,其核桃病害有发展的趋势。为消除这一潜在危险,对引起漾濞核桃病害的病原菌有所认识,进而施行有效的防治措施极为重要。本项研究从漾濞核桃感病的枝、叶上分离并鉴定其病原菌,通过室内抑菌实验筛选出防治效果较强且又经济安全的药剂,以期能防治漾濞核桃发生的病害。1材料和方法1.1pda培养基的制备从漾濞核桃植株新发生病害的核桃树枝、树叶上采集材料,在其病斑处取边长约5mm的小块材料4～5块。先用75%酒精浸5min,再在4%的次氯酸钠水溶液中浸5min,然后用75%的酒精浸30s进行表面消毒,最后用无菌水洗3至5次,放到PDA培养基中,在25℃的恒温箱中培养3～4天进行观察。将材料边缘长出的形态和颜色不同的细菌和真菌分别挑到新的PDA培养基上,培养、纯化、鉴定。1.2抑菌圈半径测定本实验的供试药剂为金雷、茂生、甲基托布津、农用链霉素和波尔多液,每种药品分别稀释400倍、600倍、800倍、1000倍、1200倍5个浓度梯度,培养时间分3个阶段:即48h、72h、96h,不同药品不同浓度分别在每个时段对YB001、YB005、YB009、YB016、YB017五个菌株进行3个重复的抑菌试验,分别测定不同药剂、不同稀释倍数及不同时间段的抑菌圈半径并取其平均值,以确定不同药剂的抑菌效果。2药剂抑菌实验对漾濞核桃病害的枝、叶共分离得到17个纯培养菌株,其中有4个菌株被鉴定到属。并对5个菌株(其中3株鉴定到属)做了室内药剂抑菌实验,实验结果表明:甲基托布津对YB001和YB009抑制效果最强,而且稀释倍数对抑菌效果影响很小,茂生次之;金雷和茂生在稀释1000～1200倍时对YB017抑制效果较好,甲基托布津对YB016和YB017基本无抑制效果,农用链霉素对YB001和YB017抑制效果较明显,波尔多液各个浓度对以上5个菌株均无抑制效果。病原菌鉴定分述如下。2.1抗病性的鉴定(1)黑盘孢科的检测YB001和YB009被鉴定为拟盘多毛孢属(Pestalotiotiopsistey)的真菌,其属半知菌类腔孢纲黑盘孢目黑盘孢科。此两种真菌菌落呈圆形生长,菌丝白色棉状突起,有同心圆(图1),室内培养5天后在菌丝上产生黑色粘性小点,即分生孢子。分生孢子盘黑色粒点状,散生,较明显,初埋于基质内,后外露,分生孢子长菱形,5胞,两端细胞近三角形,薄壁,无色;中部细胞橄榄褐色,大小为18～25μm×5～8μm,分生孢子各细胞之间均有真隔膜;圆锥形顶部有3根附着丝,基部有小柄(图2)。(2)分生孢子型YB005被鉴定为单端孢属(Trichthecium)的真菌,属半知菌类丝孢纲丝孢目淡色菌科。其菌落呈辐射状生长,菌丝稀少、无突起。室内培养3天后表面产生一层干性粉质物质,即分生孢子。分生孢子梗直立,无屈曲,不分枝,顶生孢子一至多个,分生孢子长圆形或梨形,双细胞,无色或浅色,大小14～24μm×7～14μm(图3)。(3)ybo16的识别分生孢子暗褐色,单孢,不光滑,直径为25～30μm(图4)。(4)酵母菌种或称菌气YBO18被鉴定为枝孢属(Cladosporium)的真菌,属半知菌类丝孢纲丛梗孢目暗色孢科。其分生孢子梗高,暗色直立,顶部附近各种分枝成簇生或单生;分生孢子暗色,具1或2个横隔,形状和大小不一,卵圆形、圆柱形或柠檬状等(图5)。2.2药物的抑制效果(1)各浓度梯度抑菌效果金雷对YB001菌株在400倍48h抑菌圈半径达到最大,为0.54cm;随着稀释倍数的增大抑菌圈半径逐渐变小,1200倍时抑菌圈半径最小,为0.22cm,药效不持久;72h和96h各浓度梯度抑菌效果均为零。金雷对YB005在稀释400倍、600倍48h抑菌圈半径分别为0.75cm、0.60cm,其他各浓度和时间段抑菌圈半径均为零。金雷对YB009抑制效果较好,400～1200倍5个浓度在48h的抑菌圈半径分别为1.28cm、1.26cm、0.89cm、0.85cm、0.55cm,且药效持久,72h仍有明显的抑制作用。金雷对YB016的抑制效果与YB001的相似。金雷对YB017的抑制效果与YB009的相似,对应的浓度和时间段内比YB009的抑菌圈略小。(2)抑菌圈半径的影响农用链霉素对5个菌株的抑制效果相差较大,对YB001的抑制效果最好,稀释倍数从400～1200倍5个梯度在48h的抑菌圈半径分别为1.38cm、1.15cm、1.15cm、1.02cm、0.54cm,72h仍有明显效果。对YB017的抑制效果与YB001的相似,但抑菌圈半径都小于对应浓度和时间段的半径。对其他菌株抑制效果较小,多数无抑制效果。(3)抑菌半径的测定茂生对本试验的5个菌株在稀释倍数较大和较长时间段内都有较强的抑制效果,如对YB016在96h从400～1200倍不同稀释倍数时的抑菌半径分别为1.48cm、1.14cm、1.13cm、0.91cm、0.66cm,48h和72h的抑菌半径略大于对应各数字。对其他各菌株抑制效果与YB016的很相似,其抑菌半径略小于YB016的。(4)抑菌圈半径对yb010菌株抑菌效果的影响甲基托布津对YB001和YB009的抑制效果最强,如400～1200各稀释倍数在48h的抑菌圈半径分别为1.86cm、1.44cm、1.49cm、1.50cm、1.45cm,72h和96h抑菌圈半径略微减小,对YB009菌株与YB001的抑制效果相似、略小。对YB016和YB017菌株没有任何抑制作用。3不同药剂的抑菌效果(1)拟盘多毛孢属和枝孢属真菌能使多种植物致病,多例植物病害中已报道过,但是在核桃病害中发现拟盘多毛孢属真菌尚属首次。(Pestalotiotiopsistey)真菌有性世代,故其的发现可能跟采集时间有关。YBOO5为单端孢属的真菌,据资料显示该菌是有益真菌。有的种是树栖真菌,有利于植物的物质循环,有的种食线虫,对植物起到保护作用。(2)由于真菌的鉴定大部分根据孢子的形态、大小、颜色等作出。本实验虽然分离到17种菌株,但其中大多数在正常培养条件下不产孢,因此无法鉴定。尽管我们在室内培养菌种时采用了降低营养、变温、光照等措施促使其产孢,但结果均不能产孢,培养条件有待于进一步的改进。(3)在作不同药剂的抑菌试验中,参试的金雷、茂生、甲基托布津、农用链霉素4种药剂一般稀释400倍液时抑菌效果最好,但在进行漾濞核桃病害的实际防治时,为做到既经济又安全,并考虑到高浓度农药的危害和残留问题等综合因素,一般采用600～1000倍稀释液,其抑菌效果也好。实验结果表明甲基