细胞生物学技术：GFP转染哺乳动物细胞实验和细胞的传代培养实验

GFP转染哺乳动物细胞实验和细胞的传代培养实验

实验课流程安排1.分组：A1~AD162.移液枪的介绍和熟悉:三种规格的移液枪（P1000,P200,P20）；刻度的调节；Tip头的使用。3.

实验内容简介4.实验原理和应用的介绍【转染（转染方式的介绍；脂质体转染的原理；LTX脂质体的特点）；荧光蛋白、表达质粒及其应用】5.转染的实验步骤6.实验的时间安排和注意事项（超净台操作）7.荧光显微镜的使用及注意事项8.细胞传代操作9.实验总结GFP转染哺乳动物细胞实验实验目的理解细胞转染的原理，掌握细胞转染的操作步骤学习荧光显微镜的结构、操作及注意事项学习超净台内操作及注意事项back材料转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程pEGFP-N1载体带有荧光蛋白的空质粒（看作携有外源基因的质粒）HeLaCells人宫颈癌细胞系是一种人工培养，具有无限增殖能力的细胞，1951年诞生至今已经整整60年了。在医学界，HeLa细胞被广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。HilyMax基因转染试剂日本研发的一种新型阳离子脂质体贴壁或悬浮细胞的瞬转及稳转适用于含血清的培养基，毒性低，效率高且稳定适用于siRNAOpti-MEM®Opti-MEM®无血清培养基是EMEM的改良型，其中使用了HEPES和碳酸氢钠进行缓冲，并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、微量元素和生长因子。在含血清培养基中生长的大多数细胞都能转移到Opti-MEM®培养基中。操作步骤1．细胞准备：密度40%-90%2．形成DNA-HilyMax转染复合物：3ul质粒，3ul脂质体，120ul培养液(混合后在室温下静置15-25分钟)3．添加转染复合物至细胞培养皿中4．培养：放置于37℃，CO2培养箱培养5．检测：转染后24至72小时观察要求:每小组不得超过5分钟(看好时间)戴口罩、穿鞋套入内；操作前手用75%酒精消毒。在超净台内进行关于转染（transfection）关于荧光蛋白关于脂质体转染法实验原理和应用的介绍关于转染（transfection）Transfectionistheprocessofdeliberatelyintroducingnucleicacidsintocells.Thetermisusednotablyfornon-viralmethodsineukaryoticcells.Geneticmaterial(suchassupercoiledplasmidDNAorsiRNAconstructs),orevenproteinssuchasantibodies,maybetransfected.Transfectionofanimalcellstypicallyinvolvesopeningtransientporesor"holes"inthecellmembrane,toallowtheuptakeofmaterial.DNA小片段插入体细胞或细胞系的过程，指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程

转化(transformation)指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程转导(transduction)由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一，其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中瞬转若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称“瞬时转染(transienttransfection)外源DNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达。细胞可以快速表达，迅速合成小量蛋白，但通常只持续几天。适用于验证质粒表达和监测转染步骤的效率。可以用报告基因确定优化条件。稳转若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制称“稳定转染(stabletransfection)大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释，仅小部分整合到基因组上。稳定转染的细胞系形成需数周。需要用抗药性筛选，并酶切测序鉴定。Chemical-basedtransfection：calciumphosphate

；liposomes

Nonchemicalmethods：Electroporation

Particle-basedmethods：genegun

Viralmethods：viraltransduction

Other(andhybrid)methods：nucleofection；heatshock.

转染的方法TherearevariousmethodsofintroducingforeignDNAintoaeukaryoticcell脂质体（liposome）是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体。

阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞。

其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达转染对细胞的要求：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液

转染对DNA的要求：

用于转染的质粒DNA必须无蛋白质、无RNA和其它化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的提取纯化试剂盒

靶基因被导入细胞后，一般在转染后24～72小时，可在细胞内进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）

DNA----脂质体+++++++++++细胞———————————————————报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因.把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控常用的报告基因系统:

半乳糖苷酶报告系统荧光素酶报告系统荧光蛋白报告系统(GFP)等绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，最早在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质是一个由238个氨基酸残基组成的单链，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光由水母Aequoreavictoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(seapansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点GFP的化学性质相当稳定，其变性需要在90℃或pH<4或pH>12的条件下用6mollL盐酸胍处理GFP的生色基团附着于α-螺旋上，是蛋白质自身催化环化的结果，由于环化是一个有氧过程，O2使Tyr66脱氢氧化形成生色团。因此在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光

关于荧光蛋白(reportergene)利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等GFP还常被用作荧光探针。利用信号转导中信号分子的迁移功能，将荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能

例：在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGRGFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段内被证实，根据荧光分布即可推断哪一种药物具有与hGR配体相类似的功能关于荧光蛋白pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：①该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达③具有多克隆位点，便于目的基因的插入④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达back载体名称：pEYFP-C1载体类型：哺乳动物细胞表达载体载体大小：4.7kb

载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（E.coli,Mammaliancells）细菌抗性：卡纳（kan）真核筛选标记：新霉素（Neomycin）5'测序引物：EGFP-NSequencingPrimer(#6479-1)3'测序引物：EGFP-CSequencingPrimer(#6478-1)载体描述：encodesanenhancedyellow-greenvariantoftheAequoreavictoriagreenfluorescentprotein(GFP).该载体表达一个增强信号的黄色萤光蛋白，插入的外源基因位于黄色萤光蛋白基因的3端，因此表达的蛋白为萤光蛋白在N端，外源基因在C端。该类载体可用于检测蛋白的定位，分析蛋白在细胞中的运输，以及不同蛋白的共定位等等

pEYFP-C1,PEGFP-N1两个载体都是可以用来表达融合荧光蛋白的目的蛋白载体，只是pEYFP-C1靶蛋白结合在C端,而pEGFP-N1的靶蛋白结合在N端，在用pEYFP-C1构建荧光蛋白融合表达载体时，目的基因直接连在多克隆位点后，很方便，而在用pEGFP-N1构建荧光蛋白融合表达载体时,需要把目的基因后的终止密码子去掉,并且读码框要和荧光蛋白的起始密码子相匹配。ImportantGuidelinesforTransfectionwithLTX•Theadditionofantibioticstomediaduringtransfectionmayresultincelldeathinsomecelllines.Testeachcelllineindividually.•Visit/transfectionforspecializedtransfectionprotocols(includingcell-typespecificadviceonuseofantibiotics,andaprotocolforvector-basedRNAi).•WerecommendOpti-MEM®IReducedSerumMediumtodilutetheDNAandLipofectamine™LTXReagentbeforecomplexing.•Maintainthesameseedingconditionsbetweenexperiments.Transfectioncanbeperformedbothinthepresenceorabsenceofserum.1.6ml400mlback实验目的1、通过荧光显微镜观察细胞内的荧光蛋白，从而掌握荧光显微镜的使用2、熟练掌握动物细胞的传代培养和细胞计数3、学会相关实验结果的分析荧光蛋白显微观察和细胞的传代培养实验（二）

荧光蛋白显微观察和细胞的传代培养实验（二）

传代培养的实验原理

传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作(本次实验因条件限制，只能在一个模拟的环境下进行实验)

贴壁细胞消化后的应用：

除了继续传代培养外，贴壁细胞消化后还可有许多其他的应用。1、计数、计算细胞活力，了解细胞的生长状况。2、制备细胞悬液，以备后期的继续实验。（重新铺板，MTT实验；标记、流式分析、分选；爬片、免疫荧光；电转；提取和分离；洗涤、动物注射等）**此步常省略一）细胞的传代和计数的实验步骤实验内容1．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。2．关闭超净台紫外灯，打开风机和照明。在超净台中用吸去培养皿中原有的细胞培养液。3．培养皿中加入1-2mL高压灭菌过的PBS，以洗去培养液的残留（培养液中的血清会抑制胰酶的消化作用）。洗涤可进行1～2次。4．吸去PBS，加入200µl0.125％～0.25％的胰蛋白酶，盖上盖子，轻轻摇晃，使胰酶能均匀地作用于所有皿底的细胞。室温或37°C放置1～2分钟，倒置显微镜下观察，当观察到细胞收回突起变圆时可于超净台中立即加入800µl的含血清的新鲜培养基（可37℃预热），终止胰酶的作用，经反复吹打，制成细胞悬液。5．细胞悬液制成后，即可进行传代。传代可按照1传2或者1传3等比例进行，也可在完成计数后，按一定的细胞量进行传代。细胞计数时，如果悬液的细胞浓度过大，需先按一定比例稀释后，再进行计数。通过细胞计数还可计算出细胞的活力。以稀释10倍为例，取10µl细胞悬液，加入到装有40µlPBS的Ependorf管中，再加入50µl0.4%台盼蓝溶液，混匀后吸出10µl加到计数板上进行一次计数，最终的细胞数要乘以10。另外，悬液也可收集到管中，离心后用PBS洗涤。完成3次细胞计数，计算细胞总数、活细胞数、细胞活力。将2.5

104个活细胞传35mm的培养皿。Facilitiesforcountingcells

细胞记数细胞数/ml原液=（4大格细胞数之和/4）×104

×稀释倍数Quantitationofcellviabilitybytrypanblueexclusion.Mixasmallaliquotofcellsuspensionwithanequalvolumeof0.4%trypanbluesolution.实验结果和记录一、每个实验组实验结果记录表格实验组（2.1）计数123细胞总数活细胞数细胞活力平均活力二、绘制细胞存活曲线（略）二）荧光蛋白显微观察实验内容转染试剂：LipoLTX细胞：HeLaDNA转染量：0.6μg。20X实验结果和记录细胞荧光表达率的数学统计分析实验组（A1-1）视野123细胞总数绿色荧光细胞转染效率平均转染效率实验组（2.1~2.5）组内均值组内偏差12345平均转染效率实验思考

1．什么是转染？有多少种方式？2．本次实验用的脂质体转染其原理是什么?有什么特点？3．试比较Lipo2000和LipoLTX的区别。4．细胞传代培养的目的是什么?5．如何保证在传代过程中不被微生物污染?6．贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同?7.用转染、细胞培养以及传代技术能解决哪些研究问题？徕卡DMI3000B倒置荧光显微镜荧光显微镜的原理、构造

荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用一定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。

由此可知，荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。同时，荧光显微镜必须具备相应的滤光镜系统。它是由超高压光源、滤片系统、光学系统和摄影系统等主要部件组成。12345101146（1）－投射电源开关（2）－聚光器（3）－载物台（4）－物镜（5）－调焦操纵轮（6）－透射光档片（10）－载物台操纵轮（11）－CCD光路活动杆徕卡DMI3000B倒置荧光显微镜（9）－荧光转盘（7）－荧光独立电源（8）－荧光光栅拉杆（2）－聚光器（3）－载物台（4）－物镜（5）－调焦操纵轮2345789徕卡DMI3000B倒置荧光显微镜明场：1．打开右下方显微镜透射光电源（1）。2．设置聚光器（2），若只需要普通的明场观察，将聚光器设置为“BF”。若需进行相差观察，按所选择的物镜放大倍数将聚光器设置为“PH1”(10×、20×)或“PH2”(40×)。3．将所需观察的标本置于载物台上（3）。4．选择你要用的物镜（4）(4×、10×、20×、40×)。5．利用调焦操纵轮（5）聚焦和观察图像。6．若尚需采集图像，见操作步骤13“图像采集操作”。徕卡DMI3000B倒置显微