医学细胞生物学：12-细胞衰老与凋亡

第十七章

细胞衰老和死亡

（P219）细胞衰老（aging）细胞死亡（death）Contents本章重点1.概念：细胞衰老、Hayflick界限、细胞死亡、细胞坏死、细胞凋亡、凋亡小体2.细胞凋亡的特征、与坏死的区别3.细胞凋亡的基因调控、途经4.细胞凋亡与疾病

第一节细胞衰老一、细胞衰老的概念

细胞衰老（cellularaging）是细胞内部结构的衰变而导致细胞生理功能出现衰退性的现象。（一）细胞衰老与个体衰老1.构建人体的200种细胞的寿命有显著差异，机体的寿命≠细胞的寿命同样：机体的衰老≠细胞的衰老2.从增殖能力、分化程度、生存时间三方面考虑，机体的细胞可分为4种类型：

①不断更新组织细胞一定寿命，通过增殖补充衰老细胞，维持细胞数量恒定。如：上皮细胞、红细胞

②稳定组织细胞分化程度较高，无显著衰老现象。其受到破坏丧失时，其余细胞增殖补充。如：肝细胞、肾细胞③恒久组织细胞高度分化细胞，一生中基本无更替。受损时，由相应的“干细胞”补充。如：神经细胞、肌肉细胞④可耗尽组织细胞在一生中逐渐消耗，不能补充，最后消失殆尽。如：卵巢实质细胞离体培养的细胞，若以1∶2的比率连续进行传代，则平均只能传40-60代体外培养的正常细胞经过有限次的分裂后，停止分裂，细胞逐渐衰老直至死亡的现象。增殖能力不是无限的，而是有一定界限的。(体外培养细胞最大的传代次数）Hayflick界限（复制衰老）（二）细胞的复制衰老和胁迫诱导衰老

1.细胞的复制衰老

1961年，Hayflick等发现，与机体细胞一样，离体培养的细胞也有一定的寿命。Hayflick还发现：①动物细胞在体外可以传代的次数与物种的寿命成正相关②体外培养的细胞传代次数与细胞来源个体的年龄成反比动物寿命细胞传代寿命鼠3.5年14-28

龟

175年90-125

成人成纤维细胞10-20代胎儿成纤维细胞20-50代反映了个体细胞在体内的衰老状况2.细胞的胁迫诱导衰老由于环境中刺激物诱导的细胞衰老称为细胞的胁迫性诱导衰老。如：乙醇电离辐射二、细胞衰老的特征二、细胞衰老的特征（一）细胞衰老的形态结构变化1.细胞体积缩小

衰老细胞水分的减少,原生质浓缩，粘稠度增加，失去正常形态2.膜体系的变化胆固醇含量增加，膜流动性减小，细胞功能受阻；膜出现裂隙、渗漏，细胞膜崩解。3.细胞核的变化核膜内陷；染色质凝集、固缩、碎裂、溶解；核仁不规则。4.线粒体的衰老

数目大小改变：数目减少，体积增大（肿胀），总体积下降。结构改变：嵴膜排列紊乱，嵴膜数目减少。内膜通透性改变：通透性增强5.内质网的变化

多聚核糖体减少（如：神经元中的尼氏体），出现脱粒的现象。6.致密体（densebody）的生成

致密体是衰老常见的一种结构。致密体由溶酶体或线粒体转化而来。如：脂褐质、老年色素等（二）细胞衰老的生物化学改变

DNA复制、转录和修复能力逐渐下降并停止；染色体的端粒丢失；

DNA甲基化程度逐渐降低；

蛋白质、氨基酸合成速率下降。酶含量及活性降低。例如：老年人的白发增加——头发基部黑色素细胞酪氨酸

酶活性下降的结果。三、细胞衰老学说

迄今为止曾提出过的衰老假说和理论竟多达300余种,多是从不同角度和深度反映了衰老这一复杂过程的某一侧面或层次。

概括起来主要有差错学派（Errortheory）和遗传学派（Genetictheory）两大类，

前者:强调衰老是由于细胞中的各种错误积累引起的；后者：强调衰老是遗传决定的自然演进过程。

其实，现在看来两者是相互统一的。

（一）衰老的遗传学说程序性衰老学说重复基因失活学说——基因拷贝数减少衰老基因及衰老相关基因抗衰老基因或长寿基因人的1、4、7、X号染色体上存在与衰老相关的基因。目前发现与人衰老有关的基因已达100个以上。1.衰老基因及衰老相关基因研究寿限的模式生物——秀丽隐杆线虫（平均寿命20天，适合寿限的研究）发现的衰老基因：age-1、clk、daf-2（daf基因家族成员）近年发现的衰老相关基因：p16INK4a、p53、p21、Rb基因、β淀粉样基因细胞老化相关两条主要途径：①p16-pRb途径

②p53-p21-pRb途径

★衰老实际上是一种机体防止肿瘤发生的保护性机制。2.抗衰老基因或长寿基因概念：机体内存在一些与长寿或抗衰老的基因，统称为长寿基因。如：抗氧化酶类基因（如：过氧化物酶基因）延长因子-lа（EF-lа）凋亡抑制基因prx2(调节H2O2的浓度)基因（二）衰老的损伤积累学说1.代谢废物积累学说2.自由基学说

自由基：指瞬时形成的含不配对电子、原子团，特殊状态的分子、离子。例如：(·O2-）、（·OH）、（H2O2）等

作用：●正常情况——氧化还原作用、白细胞对病原体及肿瘤的杀伤作用

●不利的一面——引发链式自由基反应3.线粒体DNA突变学说

线粒体是自由基浓度最高的细胞器，mtDNA容易受到其伤害发生突变，其结果导致呼吸链功能受阻，细胞走向衰老。4.端粒学说

DNA复制一次端粒长度减少大约50~100bp端粒学说：细胞每次分裂过程中由于DNA聚合酶障碍而不能完全复制它们的染色体，因此，端粒DNA序列逐渐丢失，最终造成细胞衰老死亡。第二节细胞死亡

细胞死亡的一般定义是：细胞生命现象不可逆的停止。根据细胞死亡的模式不同，可分为坏死(necrosis)和凋亡（apoptosis）两种类型。

Apoptosis

PCD（programmedcelldeath）一、细胞凋亡早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是创新提出的程序性细胞死亡（Programmedcelldeath,PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）

（一）细胞凋亡的概念和特征1.概念：

主动的、由基因决定的、自主结束生命的过程。（它可由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而引起）或：由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程，是细胞生理性死亡的普遍形式。★细胞凋亡现象

细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰三方面都起着非常关键的作用：

蝌蚪尾的消失

脊椎动物的神经系统的发育

发育过程中手和足的成形过程2.凋亡细胞的形态特征①凋亡起始：◆细胞表面微绒毛、突起、皱褶消失，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来；◆细胞内脱水，细胞浆浓缩，细胞体积缩小，核糖体、线粒体聚集，机构更加紧密；◆染色质逐渐凝集成新月状附于核膜周边，嗜碱性增强，细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂为大小不同的片段；②凋亡小体形成：细胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体；③凋亡细胞的清除：凋亡小体被具有吞噬功能的细胞吞噬、降解。★凋亡发生过程中，细胞膜保持完整，细胞内容物不释放，所以不引起炎症反应。空泡化固缩出芽边集凋亡小体凋亡小体：细胞凋亡时，由细胞膜出芽、包裹胞内物质而形成的大小不等的膜性小体，此小体称为凋亡小体。被吞噬细胞凋亡过程简图3.生化变化特点核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成180~200bp整数倍的核算片段。在琼脂糖凝胶电泳时呈现特异的梯状图谱。★凋亡研究模式生物：线虫C.elegans是研究个体发育和细胞程序性死亡是理想材料。因为：线虫生命周期短；细胞数量少。用体细胞突变的方法发现在C.elegans细胞凋亡中有14个基因起作用，其中Ced-3、Ced-4、和Ced-9在细胞凋亡的实施阶段起作用。

●Ced-3、Ced-4诱发凋亡，

●Ced-9抑制Ced-3、Ced-4，使凋亡不能发生。（二）细胞凋亡的分子机制1.细胞凋亡相关的基因和蛋白质

1）Caspase（天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶）基因家族

该基因家族编码一组存在于细胞质中，在细胞凋亡过程中起关键作用的酶。

（1）作用方式：特异性切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。使这些靶蛋白活化或失活。（2）Caspase的特点：

①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性②总是在天冬氨酸之后切断底物③都是由两个大亚基和两个小亚基构成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。Caspase结构及活化示意图（3）Caspase家族成员及作用现在发现哺乳动物的Caspase家族成员有15个，其作用如下表：名称及别名在细胞凋亡中的功能Caspase-1（ICE）（与Ced3同源）IL-1前体的切割，参与死亡受体介导的细胞凋亡Caspase-2（Nedd-2/ICH）起始Caspase或执行CaspaseCaspase-3（apopain/cpp32/Yama）执行CaspaseCaspase-4（Tx/ICH2/ICErel-Ⅱ）炎症因子前体的切割Caspase-5（ICErel-Ⅲ/TY）炎症因子前体的切割Caspase-6（Mch2）执行Caspase名称及别名在细胞凋亡中的功能Caspase-7（ICE-LAP3/Mch3/CMH-1）执行CaspaseCaspase-8（FLICE/MACH/Mch5）死亡受体途径的起始CaspaseCaspase-9（ICE-LAP6/Mch6）起始CaspaseCaspase-10（Mch4/FLICE2）死亡受体途径的起始CaspaseCaspase-11（ICH3）IL-1前体的切割，死亡受体途径的起始CaspaseCaspase-12内质网凋亡途径的起始CaspaseCaspase-13未知Caspase-14未知Caspase-15（Mch2）未知（4）Caspase的分类凋亡起始者：

Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10、Caspase-11凋亡执行者：

Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7

◎起始者对执行者前体进行切割，使执行者活化。2）Apaf-1该基因编码的是凋亡酶激活因子（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用。作用方式：Apaf-1具有激活Caspase-3的作用。

此过程需要：cytc、Caspase-9（Apaf-3）参与

[Apaf-1/cytc+ATP(dATP)]

↓CARD结构域（位于Apaf-1）召集Caspase-9

↓形成凋亡体CARD结构域：半胱天冬酶募集结构域凋亡复合体3）Bcl-2基因（1）Bcl-2（Bcelllymphoma-2）是编码细胞凋亡过程中的一类调节因子的基因。现已发现至少有19个同源物。（2）其产物在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放。（3）Bcl-2家族成员结构：含1~4个Bcl-2同源结构域：BH1、BH2（二者与小孔形成有关）BH3（促进凋亡）、BH4（抗凋亡）C端通常有一个疏水尾状结构——跨膜结构域

（transmembraneregion，TM）（4）根据功能的不同可以将Bcl-2基因家族分为两类：

①抗凋亡因子（anti-apoptotic）

②促进凋亡因子（pro-apoptotic）注：这些蛋白家族成员通过形成异二聚体或同二聚体调控细胞的凋亡Bcl-2家族成员结构Bcl-2相关蛋白Bik促凋亡作用示意图内源性途径线粒体应激无活性截断后产生活性，改变线粒体膜的通透性导致Cyto-C释放。Bcl-2基因导致凋亡示意图4）Fas/APO-1Fas/APO-1分别是从人的T淋巴细胞瘤KT3

细胞株及人的B细胞淋巴瘤SKW6.4株分离出的两个cDNA克隆。序列分析两者完全一致。现在二者命名为CD95Fas蛋白属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）以及神经生长因子受体家族。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白。（三）细胞凋亡信号通路细胞外的凋亡诱导因子作用于靶细胞，通过细胞内不同的信号转导通路，最终激活细胞凋亡。Caspase依赖的细胞凋亡信号通路主要有两条：

1.死亡受体信号通路2.线粒体途径1.死亡受体介导的细胞凋亡——由细胞膜上的死亡受体（deathreceptor,DR）介导，将外源性信号传递到细胞内，引发的细胞凋亡。细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的跨膜蛋白，它们包括Fas（Apo-1/CD95）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL-R1和DR5/TRAIL-R2。其配体属于TNF家族，目前已比较清楚的是Fas介导的细胞凋亡途径。

Fas具有三个富含半胱氨酸的胞外区和一个称为死亡结构域（Death

domain，DD，）的胞内区。①Fas的配体FasL（Fas

ligand）与Fas结合后，②Fas三聚化使胞内的DD区构象改变，③然后与接头蛋白FADD（Fas-associated

death

domain/

Fas相关死亡结构域）C端的DD区结合，④FADD的N端DED区（death

effector

domain/死亡效应结构域）与Caspase-8（或-10）前体蛋白结合，形成

DISC

（death-inducing

signaling

complex/死亡诱导信号复合物）

⑤caspase-8、10通过自身剪切激活，它们启动caspase的级联反应，⑥caspase-3、-6、-7激活，这几种Caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，⑦最终导致细胞凋亡。

FAS介导的细胞凋亡2.线粒体细胞凋亡途径

细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素c释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素c能与Apaf-1、caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡复合体，然后召集并激活caspase-3，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。目前普遍认为细胞色素的释放通过两种方式完成：①通过线粒体内膜改变，PT或MTPT孔开放（通透性转换孔）

②Bcl-2家族成员形成的线粒体跨膜通道释放到细胞质中的。

执行caspase前体凋亡复合体执行caspase激活促进凋亡的Bcl-2家族成员细胞内损伤线粒体介导的细胞凋亡信号通路线粒体释放的“限制性内切核酸酶G”使DNA降解DNA片段化为大约200bp倍数的片段Caspase激活的核酸内切酶（InhibitorofCAD）DNA降解细胞凋亡的信号通路获2002年诺贝尔生理学或医学奖H.RobertHorvitzJohnE.Sulston

对器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究悉尼·布伦纳（SydneyBrenner，英国），罗伯特·霍维茨（H.RobertHorvitz，美国），约翰·苏尔斯顿（JohnE.Sulston，英国），发现器官发育和细胞程序性细胞