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文档简介

转基因植物表达的RT-PCR检测实验原理

RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA为模板进行逆转录反应（reversetranscription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。RNA扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA，加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA.mRNAcDNAPCR产物一步法：利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP

直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。RT-PCR—一步法和两步法两步法：由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。RT-PCR—一步法和两步法外源基因的转录表达基因表达基因表达指基因组中某基因在细胞中转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。基因表达的改变预示着细胞在分子水平上的变化。它往往是细胞形态功能变化之前的变化。DNARNAProtein转录翻译目前研究转基因植物外源基因转录表达的常用方法1、RT-PCR(RNA)

2、Northernblot(RNA)

3、real-timePCR(RNA

）

反转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligodT,逆转录酶特异性引物,Taq酶用途:获得所需cDNA片段；检测基因表达

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