5株放线菌对靶标真菌的抑菌活性

5株放线菌对靶标真菌的抑菌活性

放线菌是主要的抗生素生产菌，是新药物、新药物和抗生素紧密结合剂的创始人。在微生物产生的1000多种生物活性物质中，50%以上的放线菌产生，可以称为二级代谢物的宝。利用放线菌的生物资源具有很大的社会和生态效应。在适合放线菌生长的各种生态环境中,土壤是放线菌的主要栖息地。西北农林科技大学植保学院植物病害生物防治研究室,从特定生态环境中采得土样8份,用“诱捕分离”法获得22株放线菌,并初步筛选出5株具有生防潜力的放线菌。本研究采用对峙法测定了这5株放线菌的皿内抑菌效果,并进一步研究了其对9种靶标真菌的持续抑菌作用和抑菌机理,为进一步研究和应用这些生防菌奠定基础。1材料和方法1.1细菌界cohicoctoni、西瓜枯草原型及灰葡萄孢菌目part、灰葡萄孢菌目partki、青霉菌和扩展青霉菌partki选择9种常见的植物病原真菌作为靶标真菌,包括梨状毛霉菌(Mucorpiriformis)、番茄叶霉菌(Fulviafulvum)、粉红聚端孢菌(Trichotheciumroseum)、西瓜枯萎菌(F.oxysporumf.sp.niveum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、苹果炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、茄子黄萎菌(Verticilliumdahliae)和扩展青霉菌(Penicilliumexpansum)。供试放线菌包括菌株SC1,SC11,A3,A4和SE2,由本实验室分离保存。1.2靶标真菌菌饼的制备将放线菌在高氏1号培养基上涂皿繁殖7d,取直径5mm的放线菌菌饼接种于PDA平板中央,置28C下培养,待定植后将在PDA平板上,培养繁殖5d的2块直径5mm的靶标真菌菌饼,对称接种于距放线菌菌饼25mm处,转入25C下继续培养。72h后开始测量2块菌饼间靶标真菌的菌落半径,根据下面公式计算抑制率,每处理重复3皿。1.3关于抗菌丝的微观观察在被抑制的菌落边缘,挑取少量靶标真菌基内菌丝,镜检观察菌丝被抑制情况,并进行显微照相。1.4再生对真菌生长的影响从被抑制的菌落边缘,挑取少量靶标真菌基内菌丝接种于PDA平板上,以正常基内菌丝为对照,在25C下培养,定期观察菌落生长情况,测量菌落直径,确定受抑制靶标真菌菌丝的再生能力。每处理重复3皿。2结果与分析2.15不同生防放线菌的抑菌活性采用平板对峙法测定了放线菌对靶标真菌的抑菌效果,结果(表1)表明,5株放线菌对9种靶标真菌均有一定的抑制作用。菌株SE2表现最为突出,对梨状毛霉菌、灰葡萄孢菌和立枯丝核菌均表现出显著的抑制作用(抑制率>80%),对苹果炭疽菌和番茄叶霉菌也有较显著的(80%≤抑制率≤65%)抑制作用;菌株A3对灰葡萄孢菌和立枯丝核菌,菌株A4对梨状毛霉菌和立枯丝核菌也表现出显著的抑菌作用。从不同生防放线菌对同种靶标真菌的作用效果可以看出,对梨状毛霉菌、灰葡萄孢菌和立枯丝核菌有明显抑制作用的菌株数最多,尤其对梨状毛霉菌和立枯丝核菌,5株放线菌均表现出显著或较显著的抑菌活性。总的看来,菌株A4和SE2既表现出了稳定的抑菌效果,而且被抑制的真菌种类较多、作用较强。2.2菌株sc11对基内真菌基内菌落的影响显微观察发现,受抑制靶标真菌的菌丝形态均发生了显著的变化,但变化的细节有差异。菌株SC1作用于靶标真菌粉红聚端孢菌、苹果炭疽菌、梨状毛霉菌、灰葡萄孢菌,菌株A4作用于靶标真菌粉红聚端孢菌、苹果炭疽菌、灰葡萄孢菌、茄子黄萎菌和西瓜枯萎菌,以及菌株A3作用于靶标真菌茄子黄萎菌和苹果炭疽菌后,均观察到其基内菌丝发生了畸变、原生质浓缩等现象(图1)。粉红聚端孢菌、梨状毛霉菌、西瓜枯萎菌和灰葡萄孢菌4种靶标真菌受菌株SC11抑制后,镜检可以发现其基内菌丝的细胞壁被消解,原生质浓缩、外露(图2)。由此可以看出,经放线菌处理后,靶标真菌的基内菌丝不同程度发生了畸变,且随处理时间的延长畸变程度随之加强,推测放线菌很可能分泌了某种降解细胞壁的酶类和作用于原生质体的有毒次生代谢物质。2.35放线菌对供试靶标真菌生长的抑制效应为了进一步测定解除放线菌分泌的抑菌物质后,靶标真菌中受抑制的菌丝能否恢复其生长能力,即放线菌对靶标真菌是否具有持续抑菌作用,本研究测定了受抑真菌菌丝的再生能力,结果见图3～6。由图3,4可知,番茄叶霉菌受菌株SC11,A4抑制后、苹果炭疽菌受菌株A3,A4抑制后,被抑制的菌丝在正常条件下仍然可以恢复生长,但生长速率非常缓慢,且日生长量远低于对照,这表明放线菌的抑制效应在靶标真菌菌丝中可以持续一定的时期;梨状毛霉菌受菌株A4和SE2抑制后(图5),被抑制的菌丝同样在24h后才缓慢恢复生长,但此后菌落的日生长量很小,且菌落颜色加深、菌丝稠密;立枯丝核菌受菌株SC1,SC11,A3和SE2抑制后,受抑制的菌丝在正常条件下生长明显滞后,24h内其生长量很小,此后才逐渐恢复生长(图6),同时可以在其菌落中间观察到黄白色晕圈。从表2可以看出,5株放线菌对供试靶标真菌均不同程度表现出了持续抑菌作用,同一放线菌的持续抑菌作用谱不同,同一靶标真菌被永久抑制的放线菌种类和数量也不同。其中菌株SC1,A3和A4表现的抑菌作用最强,分别对3种靶标真菌产生了持续抑菌作用;菌株SE2和SC11也对1种或2种靶标真菌具有持续抑菌作用。在供试的9种靶标病原真菌中,能够对西瓜枯萎菌产生持续抑菌作用的放线菌种类最多,而所测的5株放线菌对苹果炭疽菌均不产生持续抑菌作用。3对被抑制真菌病原菌再生能力的测定植物病害生物防治成功与否,关键的问题是能否获得名副其实的高效菌株。皿内检测作为筛选有效生防菌的一种重要方法,具有检测简便、快捷的特点,但皿内检测结果与活体试验相关性的不稳定,在很大程度上限制了这种方法的推广应用。本研究在以皿内对峙法初步确定了待测放线菌菌株抑菌效果的基础上,重点对被抑制真菌菌丝体的再生能力进行了测定,以明确在解除待测放线菌的抑制作用后,被抑制菌丝能否恢复生长,这作为生防菌的一项皿内筛选指标具有极为重要的应用价值。从本研究结果可以看出,待测放线菌对靶标真菌的皿内抑菌作用,与对受抑菌丝再生能力的影响(即持续抑菌作用)是两个不相关的性状,如菌株A4和SC1对立枯丝核菌的皿内抑制率均为91.03%,在解除抑制物之后,受SC1抑制的立枯丝核菌菌丝可以逐渐恢复生长,而菌株A4对立枯丝核菌达到了持续的抑制效果;菌株SC1对番茄叶霉菌的皿内抑制率虽然只有50%,但对靶标真菌也达到了持续抑菌作用。本试验中,对受