猪近交系主动脉内皮细胞lr2表达及lr2介导内皮细胞lr2的表达

猪近交系主动脉内皮细胞lr2表达及lr2介导内皮细胞lr2的表达

0血管内皮功能异常【研究意义】小型猪（wzbs）的杂交系统（国家发明奖（zl081430.9））是中国宝贵的小型猪资源之一，由中国农业科学院北京兽医研究所培育。大量研究结果证实,WZSP近交系是生物医学研究的理想供体,已经广泛应用于药学、畜牧兽医学和人比较医学研究。血管内皮细胞在调节血管功能和维持血管内环境中起重要作用,许多心血管疾病的发生与血管内皮细胞的功能异常有关。目前,血管内皮细胞的体外培养已广泛用于心血管疾病的研究。【前人研究进展】血管内皮细胞的体外培养方法基本上都是在Jaffe等方法的基础上加以改进并形成的,细胞的材料多来源于人,如人的脐静脉和脉动脉等。近年来,关于牛、兔、鼠和猪等来源的血管内皮细胞体外成功培养均有报道。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)被认为是一种慢性炎症性疾病。Toll样受体(toll-likereceptors,TLRs)TLR2是一种介导天然免疫的跨膜信号传递受体,其在AS的发生发展中起重要的作用;并且已证实其在动脉粥样硬化斑块处内皮细胞中高效表达,而且血管分支处及血流动力学改变部位的内皮细胞TLR2的表达量也明显升高。高脂饮食诱导发生AS的TLR2/LDLR双基因缺失小鼠和LDLR基因缺失小鼠相比较,TLR2的缺失明显抑制了AS的发生发展。许多学者致力于研究TLR2在促进AS和炎症反应中作用,但具体作用机制有待进一步的研究。【本研究切入点】目前,TLR2在猪主动脉内皮细胞中的表达及其在介导细胞炎症相关因子的表达情况未见报道;为此,本试验利用WZSP近交系主动脉内皮细胞的体外培养模型,探讨TLR2在内皮细胞炎症相关因子表达中的作用。【拟解决的关键问题】进一步揭示TLR2在内皮细胞炎症反应的作用,为今后进一步研究WZSP近交系内皮细胞的免疫应答机制以及TLR2在AS中的作用奠定基础。1材料和方法本试验于2009年9月—2010年10月在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所进行。1.1实验动物WZSP近交系由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供,选取3—4月龄、体重10kg左右、健康状态良好的五指山小型猪进行试验。1.2试剂和仪器I型胶原酶、DMSO及LPS均购自美国Sigma公司;DMEM高糖培养基、双抗、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、胰酶、谷氨酰胺及D-PBS为GIBCO公司产品;CellCountkit(CCK8)为日本DojindoLaboratories的产品;LTA为invivogen公司产品;DiI-Ac-LDL购自友谊中联生物科技有限公司;小鼠抗猪的CD31﹕RPE单克隆抗体为英国AbDSerotec公司产品;RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;荧光定量PCR试剂购自天根生化科技有限公司;荧光定量PCR的引物由上海英俊公司合成。1.3血管内皮的制备打开3—4月龄WZSP近交系的胸腔和腹腔,剥离胸腹主动脉,将其两端结扎并切断,放入含双抗的PBS液(pH=7.4,下同)中带回细胞室。将主动脉放在无菌平皿中,剔除外膜周围的结缔组织,用含双抗的PBS冲洗主动脉外膜2—3次;解开主动脉结扎的两端,用含双抗的PBS冲洗主动脉血管腔的内膜,至清亮液体流出。将整根主动脉剪成3cm左右的小段,用无菌棉线结扎一端,使用两把顿头镊子配合将血管的内膜外翻,放入0.1%的I型胶原酶溶液中使血管内膜充分接触酶液,于37℃消化15min。消化结束,吸取消化液,冲洗已被胶原酶消化松动的内皮细胞。收集液体转至新的灭菌离心管中,于1000r/min离心5min,弃掉上清液,细胞沉淀用含20%FBS的DMEM培养液重悬、混匀,加入到培养瓶中。置于CO2恒温培养箱中,于37℃、5%CO2和饱和湿度条件下静置培养。1.4细胞传代处理当细胞长至80%时,弃去培养液,用PBS清洗2次,加入0.25%胰酶消化细胞,于显微镜下观察。当细胞开始变圆时,用含有血清的培养基终止消化,吹打细胞使其完全脱落,以1﹕2的比例进行传代。取传至第2代的细胞,胰酶消化法收集细胞,离心弃上清,用细胞冻存液(10%DMSO+30%FBS+60%DMEM)重悬细胞,–80℃冰箱过夜,次日投入液氮罐中长期保存。复苏细胞时,从液氮中取出冻存管,于38℃水浴锅中融化,离心弃上清,加入细胞培养液重悬细胞,37℃和5%CO2的培养箱中继续培养。1.5cck8对od值的测定取第3代的内皮细胞,用0.25%的胰酶消化后,以2.0×103个/孔接种于96孔培养板。每天在相同时间点向3个平行的孔内加入CCK8,2h后吸取细胞上清液在酶标仪450nm处测OD值,连续定时测定7d。同时,另外选一孔作阴性对照,不添加CCK8,只是与同时间吸取上清测OD值。根据测得OD值与对应天数绘制曲线。1.6动脉内皮细胞的识别1.6.1管内皮细胞的培养用血管内皮细胞株(PIEC)作为对照组,将主动脉血管内皮细胞接种于96孔板,待细胞长满后去除培养液,每孔加入终浓度为10μg·mL-1DiI-Ac-LDL的完全培养液37°C孵育4h后于荧光显微镜下观察。1.6.2流式细胞术检测细胞系统中蛋白mf细胞内皮细胞收集3管主动脉内皮细胞和1管猪血管内皮细胞株(porcinevascularendothelialcellline,PIEC),每管1.0×106个,加入PBS冲洗2—3次,弃上清,分为空白对照(不加抗体),阴性对照(加同型对照抗体,并无细胞抗原特异性)和抗体CD31标记的内皮细胞,进行流式细胞仪检测。1.7细胞炎症因子以1.0×105个/孔的细胞浓度接种于12孔培养板,参考文献报道,并经过预实验后,选取浓度为1μg·mL-1LPS添加到细胞培养液中0、6、8和12h后,利用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,并将RNA反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR检测TLR2和TLR4的表达量。1μg·mL-1LPS刺激内皮细胞12h后,换液添加10μg·mL-1LTA或无LTA的完全培养液孵育0、6和12h,提取细胞总RNA,反转录成cDNA,实时荧光定量PCR检测细胞炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的表达量(引物见表1)。实时荧光定量PCR总反应体系为20μL,即RealMasterMix(SYBRgreen)9μL,cDNA1μL,正、反向引物各0.6μL,无菌水8.8μL,总体积为20μL。扩增条件:95℃2min;95℃15s、60℃30s、68℃30s,共40个循环;每个循环于68℃延伸期收集荧光信号;95℃15s、60℃15s,作60—95℃范围的融解曲线。在ABI荧光定量PCR仪7500反应完毕后,由SDS软件自动分析结果。基因的表达分析利用比较Ct法的相对定量,Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。假设目的基因与管家基因扩增效率相同,数学推导得出,目的基因的量=2-△△Ct。△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)试验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照,以管家基因GAPDH为内参。2-△△Ct表示试验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。1.8免疫组化检测试验数据以“⎯x±s”表示,用SPSS11.5统计软件进行统计分析,组间差异性比较采用单因素方差分析,以P<0.05具有统计学意义。出,以至于酶液不能和内皮细胞充分接触,起不到很好的消化作用。将血管内膜外翻可以改进这种方法,不仅方便将内膜表层冲洗干净,避免血红细胞的残留;也能使内皮细胞层和消化酶液充分接触,避免了外膜接触酶液导致消化液中混入杂细胞。内皮细胞的鉴定也很重要,是细胞培养中的重要环节。鉴定内皮细胞的方法很多,首先显微镜下观察细胞形态。本试验分离的细胞汇合长成单层后形态为铺路石样整齐排列,细胞呈不规则的多角形和短梭形,符合内皮细胞体外培养的形态特征。其次可以做细胞第Ⅷ因子相关抗原的免疫组化检测或Ac-LDL受体的表达检测。第Ⅷ因子相关抗原是血管内皮细胞的一个可靠的标记物,多采用荧光标记的抗体进行免疫荧光染色来检测。检测Ac-LDL受体采用直接掺入DiI标记的Ac-LDL,通过荧光显微镜下观察细胞吸收Ac-LDL的结果,证明细胞表面是否有此种受体。另外,CD31也是内皮细胞一个标志性的表面分子。本试验分离培养的内皮细胞吸收DiI-Ac-LDL后,可观察到细胞质有明显的红色荧光,并且流式细胞仪鉴定CD31分子表达为阳性,证实本试验分离的细胞是血管内皮细胞。TLRs是一类介导天然免疫的信号传递受体,能够识别特异的PAMPs,介导宿主细胞的免疫应答。对猪主动脉内皮细胞进行检测后发现,细胞几乎不表达TLR2,不能对LTA产生免疫应答。那么在免疫炎症反应中革兰氏阳性菌是如何激活内皮细胞的?本试验通过LPS刺激主动脉内皮细胞后TLR2表达量明显升高,进而能够对LTA产生应答;与无LTA刺激的细胞相比,内皮细胞TLR2与LTA结合引起细胞炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的显著表达。文献报道,P.gingivalis细菌感染人主动脉内皮细胞,促进TLR2和TLR4的表达量升高;人脐静脉内皮细胞经TNF-α、LPS或IL-1β刺激后,能显著增加TLR2mRNA水平表达量,并且内皮细胞通过TLR2对LTA产生应答,引起炎症因子E-selectin和IL-8的表达量升高。同时,研究报道,来自H.pylori和P.gingivalis两种细菌的LPS导致了TLR2持续激活内皮细胞,在AS斑块发生的炎症反应应答中起了重要作用。通过发生AS小鼠的体内试验发现,在血流动力学紊乱的部位,如血管分支处TLR2的表达及活性均增加,并促进EC的活化,引起