实验小鼠胚胎移植方法的比较

实验小鼠胚胎移植方法的比较

自20世纪50年代建立了精细分泌和胚胎采集技术以来，从第一胚胎到受体母亲的胚胎移植技术的开发和研究迅速完成。小鼠的胚胎移植技术对于实验动物学研究及生命科学研究具有重要价值。人类对小鼠进行发育生物学研究,包括胚胎的发生、发育、突变基因的研究、转基因动物的研究、基因打靶技术及小鼠胚胎冷冻种子库技术等涉及胚胎体外操作的各种研究,均需要进行胚胎移植入受体母体内来完成。按照胚胎发生的阶段不同,移植部位也不同。1-2个细胞期胚胎进行输卵管口移植,8细胞期至桑椹期胚进行子宫移植。1992年,日本学者Nakagsta又报道了经由输卵管壁进行输卵管移植的技术,以解决移植中一些受体品系输卵管口较小、较短的问题。本文主要是将此三种移植方法引入,使之在本实验室成为常规后,将其应用于实验小鼠并进行了方法上的比较,重点比较了方法上的难易程度、产仔率、方法选择的前体因素。1材料和方法1.1实验动物的制备实验动物以1月龄左右的近交系FVB、DBA/2雌性小鼠各135只作为胚胎提供者,以2-3月龄的封闭群CD-1雌性小鼠180只作为移植受体,3月龄的封闭群CD-1雄性小鼠30只制作结扎公鼠,实验动物均购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,均为清洁级。1.2绒促性素hcg注射用血促性素PMSG(pregnantmareserumgonadotropin),批号:0001102,规格:1000U/支;注射用绒促性素HCG(humanchorionicgonadotropin),批号:0009101,规格:500U/支,均购自上海第一生化药业公司;DPBS、M16培养基均购自上海生物工程有限公司。1.3创造虚假怀孕母亲的准备1.3.1输精管结扎手术为输卵管移植及子宫移植用受体母鼠(CD-1)交配用的雄性CD-1小鼠进行输精管结扎手术,以便制备假孕母鼠。进行输精管结扎手术的雄性CD-1小鼠应提前3w施行手术,术后1w先试配一次将输精管中的余精去除,以后备用。1.3.2阴道栓形成者为受母鼠胚胎移植前一日(子宫移植前3d)将已施行输精管结扎手术术后3w的CD-1雄性小鼠以1∶1与其雌性小鼠进行合笼交配,次日检查阴道栓形成者作为移植用受体母鼠。1.4为老鼠做准备1.4.1hcg超排取出生后4-5w的FVB及DBA/2雌性小鼠进行PMSG处理(腹腔注射,5IU/只),48h后进行HCG超排卵处理,方法、剂量相同,HCG处理后16-19h内可进行受精卵的采集(子宫移植为HCG处理后第3d)。1.4.2接口配置取已注射PMSG、HCG后的FVB、DBA/2雌性小鼠与其相对应的正常的FVB、DBA/2雄性小鼠进行合笼交配,比例为1∶1。1.5精子采集无菌条件1.5.1卵丘细胞增殖培养取合笼交配后阴道栓阳性的雌性FVB、DBA/2小鼠,断椎处死后仰面(腹部朝上)置于解剖台上,酒精消毒后剪开外皮、真皮、打开腹腔,剪下整段输卵管,置于盛有DPBS的平皿中,体视显微镜下找出输卵管的膨大部并用显微镊子撕破,使其中的包裹着卵丘细胞的受精卵团释放出来,用透明质酸酶消化卵丘细胞,再用受精卵采集毛细管将培养液中的受精卵转移到M16培养液中(30μl/滴),并连续同样洗4-5次,最终将受精卵置于微滴培养液(30μl/滴)中,放入37℃、5%CO2培养箱中培育3-4h,等待移植。1.5.2阴道感染精子的制备将合笼交配后阴道栓阳性的雌性FVB、DBA/2小鼠挑出,单独饲养至第3d(8细胞期胚)处死,剪开外侧皮肤后,打开腹腔后找到子宫,将子宫与输卵管连接的根部剪断,放入盛有DPBS缓冲液的平皿中,并剪掉系膜及附着物后放入盛有M16培养液的平皿中,在1ml针管中吸入0.5-0.6mlM16培养液从阴道根部扎入到子宫中将M16冲入子宫中,反复3次冲洗后用8细胞胚采集用毛细管将受精卵移至盛有三滴M16培养液平皿中的一滴,同样方式再洗2次后置于第三滴M16中,放入37℃、5%CO2培养箱中培育3-4h,等待移植。1.6胚胎移植1.6.1体母鼠卵巢膜移植麻醉受体母鼠并进行胚胎移植显微手术。小鼠消毒杀菌后,剪开毛皮层、真皮层,体视显微镜下取出卵巢部,剪开卵巢膜,将1细胞期胚经受体母鼠输卵管伞口移植入受体母鼠输卵管中。将卵巢部轻推进小鼠体内,进行真皮毛皮术后缝和,消毒伤口,注意保温,第2d观察至苏醒后置于小鼠饲育室中至仔鼠出生。1.6.2成虫液移植入分配部位麻醉受体母鼠并进行胚胎移植显微手术。小鼠消毒杀菌后,剪开毛皮层、真皮层,体视显微镜下取出卵巢部,在输卵管伞端至壶腹部之间靠近壶腹部1/3处的输卵管壁切一斜口(250μm左右),将受精卵经由此剪开的斜口移植入壶腹部内。将卵巢部轻推进小鼠体内,进行真皮毛皮术后缝和,消毒伤口,注意保温,第2d观察至苏醒后置于小鼠饲育室中至仔鼠出生。1.6.3显微子法麻醉受体母鼠并进行胚胎移植显微手术。小鼠消毒杀菌后,剪开毛皮层、真皮层,体视显微镜下找出一侧子宫,左手以显微镊子轻轻夹住子宫与输卵管结合部使子宫与鼠体成45°角,右手用5号针头经由子宫壁扎入子宫腔内,上下轻轻移动以确认针头未扎入子宫腔内壁,同时迅速沿这个针眼将移植用毛细管扎入并轻轻将卵吹入子宫内。将卵巢部轻推进小鼠体内,进行真皮毛皮术后缝和,消毒伤口,注意保温,第2d观察至苏醒后置于小鼠饲育室中至仔鼠出生。1.7处理数据运用统计软件对数据进行卡方检验。2种胚胎移植方法及两种品系小鼠产仔数的卡方检验比较进行三批实验,各批实验的三种移植方法结果比较分别见表1、表2、表3,三种胚胎移植方法产仔数的卡方检验及两种品系小鼠产仔数的卡方检验分别见表4、表5。3不同类型受精神血药率大鼠胚胎受孕率及产仔数的比较引进的这三种胚胎移植方法,在我们的实验条件下同样取得了一定的可比性结果。从表4来看,这三种移植方法之间差异显著,而且从表1、2、3中的生产受体母鼠及产仔数来看,输卵管壁移植优于输卵管伞口移植,这是因为输卵管壁移植对受体母鼠的损伤极小,使受体母鼠的生存率、受孕率及产仔数受到的影响不大;但输卵管伞口移植又优于子宫移植,这是由于胚胎体外培养的条件终不如体内的自然发育,即使移植进入体内,其内外环境差异的刺激也将使胚胎死亡率提高,极大地降低了受体母鼠的受孕率及产仔数。从表5来看,胚胎供体品系FVB小鼠与DBA/2小鼠之间的产仔数差异是极显著的,FVB受体母鼠的产仔数明显高于DBA/2受体母鼠,这是由于FVB小鼠的繁殖性能及生命力总体上比一般近交系小鼠强,这与国际上一般也采用FVB小鼠作为转基因的载体动物的理论依据是一致的。虽然我们的受体母鼠与国外使用的一样,有很好的受孕能力和母性,但同国外的工作相比,我们实验条件下的产仔率平均较之低约3%-10%,分析其原因如下:一是国际上一般使用的是SPF级的小鼠,至少是清洁级小鼠,而我们使用的则是清洁级来源的普通级小鼠;二是实验及技术条件的限制。因此,可以从不同的实验研究目的来选择不同的移植方法。通常,进行小鼠胚胎冷冻种子库建库,经由小鼠受精卵雄性前核显微注