小鼠神经干细胞免疫原性研究

小鼠神经干细胞免疫原性研究

近年来，随着细胞生物学和生物学技术的进展，神经移植成为科学研究的热点。神经干细胞具有自我更新和分化为神经元及神经胶质细胞的潜能,从而可以修复受损的神经组织。因此,神经干细胞在治疗神经创伤、梗塞及神经系统退行性变等众多疾病方面,具有着充满希望的前景,近年来经过众多学者的努力已经取得了一些令人振奋的成果。但神经干细胞移植技术最终要应用到临床,就不能回避免疫排斥的问题。在近十余年来的人类神经移植研究中,我们对神经系统的免疫学特性,了解还不是十分充分。本研究试图探讨小鼠神经干细胞免疫原性,以利于解决神经干细胞移植中的免疫排斥问题。1材料和方法1.1第二、实验添加剂及剂量实验动物C57BL/6近交系小鼠和BALB/c近交系新生鼠均由浙江大学实验动物中心提供。DMEM/F12培养基、B27添加剂、胰蛋白酶均购于Gibco公司,表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及丝裂霉素购于Sigma公司。一次性塑料培养瓶为Orange公司产品,氚标胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)购自AmershamPharmaciaBiotec,小鼠MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ单克隆抗体均购自eBioscience。1.2方法1.2.1pbs处理及体外膜消化取BALB/c新生鼠,以戊巴比妥钠麻醉后处死(所有动物实验均按照大学动物实验委员会章程进行),解剖并分离海马组织,以pH为7.4的PBS缓冲液漂洗干净后,将组织碎片置于试管中,加入0.5g/L的胰酶和0.12g/L的EDTA,37℃消化15min,然后以玻璃吸管吹散,细胞计数显示,80%以上细胞活力良好。利用无血清培养(DMEM/F12,B2720mL/L,EGF20μg/L,bFGF20μg/L),悬浮培养神经干细胞,传代并做单克隆扩增和分化,应用CD133免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞。1.2.2被免疫c7bl/6小鼠将制备的NSCs,以丝裂霉素灭活后分别腹腔免疫C57BL/6小鼠15只,1×106细胞/只,1次/周,连续3周,最后1次免疫后第4天处死小鼠。1.2.3细胞培养细胞fcs无菌条件下摘取C57BL/6免疫小鼠小鼠脾脏,放入研钵中充分研磨,加入10mL无血清RPMI1640于研钵中,经200目钢网过滤去处脂肪组织,制取细胞悬液并转移至15mL离心管中,1000r/min离心15min,弃上清,加入2mLTris-NH4Cl溶解红细胞,无血清RPMI1640洗2遍后,用含FCS(100mL/L)的RPMI1640培养基重悬细胞,将细胞悬液倒入玻璃平皿中,于37℃温箱静置30～40min,使单核细胞贴附于玻璃平皿上。用毛细吸管轻轻吸取未黏附的细胞悬液,即获得去除单核细胞的T淋巴细胞悬液。然后用含FCS(100mL/L)的RPMI1640培养液调整T淋巴细胞悬液密度为1×109/L,以每孔100μL体积加入圆底96孔板,作为应答细胞。然后将制备的C57BL/6小鼠神经干细胞,用培养液调整细胞密度2×108/L后,按40～50μg/105比例加入丝裂霉素37℃避光、摇晃处理30min,PBS洗涤3次,RPMI1640培养液重悬,再按每孔100μL加入到已铺有受体淋巴细胞的96孔板中,每组设3个复孔,作为刺激细胞。刺激细胞与应答细胞比例为1∶5。然后200g离心5min,使神经干细胞和淋巴细胞充分接触。再置于37℃、50mL/L的CO2孵箱中培养120h。培养结束前16h,加入[3H]-TdR(0.8μci/孔)。1.2.4cpm值的测定以多头细胞收集仪将细胞收集到滤纸上,液闪计数仪检测细胞内掺入[3H]-TdR后形成的每分钟脉冲数,即cpm值,每组结果以3孔的平均值计算。1.2.5mhc-和mhc-i-a/i-e的标记作用传代培养的NSC消化后移入流式试管,随机分为10组,细胞数约5000/组,1500r/min离心约5min后,每管加入FITC标记的anti-mouseMHCclassⅠ及PE标记的anti-mouseMHCclassⅡ(I-A/I-E)各1μL,分别标记MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ,常温下作用15min。以PBS400μL洗涤1遍后,再以PBS400μL重悬,然后利用FCM检测NSC中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ阳性细胞比例。1.2.6小鼠骨髓细胞培养取BALB/c新生鼠,无菌条件下摘取肝脏,应用seglen灌流法制备肝细胞,经传代培养纯化后,上述同样方法腹腔免疫C57BL/6小鼠15只,最后1次免疫后第4天处死小鼠,收获T淋巴细胞。然后取同一批肝细胞,以丝裂霉素灭活后与收获T淋巴细胞行单向混合淋巴细胞培养,用[3H]-TdR标记并检测cpm值。并且按照NSC组同样方法分组、标记及检测肝细胞组中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ阳性细胞比例。1.2.7统计分析计量资料用x¯±sx¯±s表示,两组数据之间比较采用t检验。2结果2.1神经胞菌体形态变化按克隆密度培养的神经干细胞生长成神经球,神经球形态规则,培养液中悬浮生长。加血清培养后,神经干细胞发生贴壁分化,大量细胞发生迁移,呈现胶质细胞形态。CD133免疫荧光染色显示游离及构成神经球的细胞均呈阳性,说明它们可能是具有分化潜能的神经干细胞(图1)。2.2两组cpm值的比较与肝细胞对照组比较,NSC组合成代谢中摄取的[3H]-TdR较少,因而液闪计数仪检测所得cpm值较小。两组cpm值(NSC组16592.8±2865.3、肝细胞组27815.0±2416.3)的比较采用t检验,P<0.001,其差异有统计学意义。从以上可见,NSC组cpm值明显低于肝细胞对照组,说明NSC组T淋巴细胞增殖水平明显较肝细胞对照组低,从而可以推断NSC的免疫原性明显低于同一个体之肝细胞。2.3小鼠肝脏mhc-和mhc-表达情况-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达小鼠NSC实验组中,大部分体外培养的增殖期神经干细胞没有检测到MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达,且MHC-Ⅰ类分子的平均表达比例略高于MHC-Ⅱ类分子。各组平均值为:单独表达MHC-Ⅰ分子(4.12±1.48)%、MHC-Ⅱ分子(1.75±0.84)%,两类分子均表达约(6.58±1.46)%,均不表达约(87.55±3.65)%。而作为体细胞对照组的小鼠肝细胞组中,仅有约(27.45±1.86)%的肝细胞未表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子,单独表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子平均比例分别为(19.98±2.87)%及(15.76±2.91)%,两类分子均表达约(34.28±2.08)%。比较两组MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ阴性细胞比例,P<0.01为差异有统计学意义。3神经干细胞的免疫原性神经干细胞的免疫原性是影响移植免疫排斥反应的一个重要因素。细胞的免疫原性主要是由其表达的主要组织相容性抗原复合物所决定的。关于神经干细胞的免疫原性,目前尚无公认的看法。混合淋巴细胞培养是目前经典的用于体外检测免疫原性的方法,通过不同个体间存在MHC异质性,可刺激淋巴细胞转化并增殖,检测掺入的[3H]-TdR,即可反映免疫原性的强弱。本实验第一部分通过主动免疫的方法,诱导特异的致敏淋巴细胞,然后再进行单向混合淋巴细胞培养试验,使增殖反应具有较高的特异性和敏感性。实验发现神经干细胞作为丝裂原能在一定程度上刺激T淋巴细胞增殖,但增殖程度较低,且明显低于作为对照的小鼠肝细胞。由此可以推测其免疫原性较弱。主要组织相容性抗原复合物是引起免疫排斥的主要抗原,尤其是MHC-Ⅱ是异体排异较重要的抗原性物质,其通过抗原提呈而导致严重的排斥反应;目前一般认为MHC-I可能引起较轻微的免疫反应。Modo等认为,处于增殖状态的神经干细胞既表达MHC-Ⅰ类分子又表达MHC-Ⅱ类分子,而当神经干细胞发生分化,处于非增殖状态时,两类MHC分子表达量均明显下调,甚至难以检测出来。此外,也有研究者指出在体外神经干细胞仅表达MHC-Ⅱ类分子,并且于细胞移植后第6周,其表达量开始下调。本实验第二部分通过FCM检测了增殖期小鼠NSCs及肝细胞表达MHC-Ⅰ类分子及MHC-Ⅱ类分子的比例。发现体外培养的增殖期神经干细胞单独表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子平均比例分别为(4.12±1.48)%及(1.75±0.84)%,两类分子均表达约(6.58±1.46)%,而高达(87.55±3.65)%的增殖期神经干细胞没有检测到这二类分子的表达,且MHC-Ⅰ类分子的平均表达比例略高于MHC-Ⅱ类分子。同时作为对照组的小鼠肝细胞组中,仅有约(27.45±1.86)%的肝细胞未表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子。结果表明,体外培养的神经干细胞主要组织相容性抗原复合物(Ⅰ、Ⅱ)表达率均较低,且作为异体排异反应中最重要的抗原性物质的MHC-Ⅱ类分子,表达率更低。因此,这部分实验从分子学基础上,证实了神经干细胞具有较弱的免疫原性,而且其