基因工程复习资料

#绪论第一节ThebirthofGeneticEngineering一．基因工程的定义在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。二．基因工程诞生的理论基础DNA是遗传物质（1）肺炎双球菌转化实验（2）噬菌体转染实验DNA双螺旋结构三．基因工程诞生的技术突破限制性内切酶（restrictionenzymes）DNA连接酶（ligase）载体（vector）感受态体系（competence）琼脂糖凝胶电泳6.DNA测序技术四．基因工程的诞生Berg的开创性实验Boyer-Cohen实验六．基因工程的特征跨物种性无性扩增七．基因工程的主要操作内容目的基因的获取重组体的制备重组体的转化克隆鉴定目的基因表达第二节基因工程的安全性一、基因工程的安全隐患对环境的影响新型病毒的出现癌症扩散人造生物扩散二、重组DNA研究的安全准则公众的担忧专家的态度制定安全规则基因工程的安全措施（1）实验室的物理安全分4级：P1—P4级。（2）实验室的生物安全分3级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。（3）载体的安全第三节基因工程的应用一、基因工程在农业生产中的应用提高植物的光合作用效率（1）提高CO2的固定率（2）提高光能吸收率和转化率提高豆科植物的固氮效率转基因植物转基因动物二、基因工程在工业中的应用纤维素的开发利用酿酒工业三、基因工程在医药上的应用用转基因植物或动物生产药物用微生物生产药物技术设计高效高特异性的生物制剂研制疫苗基因诊断法医鉴定基因治疗四、基因工程在环境保护中的应用检测水污染生物降解第四节基因工程技术的商业化发展一、商业投资支持现代生物技术研究二、基因工程商业化特点技术密集型（1）产品来源于实验室（2）科学家往往就是公司的领导人市场扩张迅速投入巨大风险太高产品不断增加研究专一、产品专一医学生物技术产业进展最快专门为基因工程实验提供研发试剂的公司第一章基因工程的主要技术原理第一节DNA的提取与纯化一、质粒DNA的提取1.碱抽提法提取质粒DNA（1）原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质一SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。（2）所用的试剂作用溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的0-1,4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。乙醇用于沉淀DNA。RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。酚-氯仿蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤第一步：溶菌使用“溶液I”溶解细菌细胞壁。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。第四步：离心除去沉淀上清液中含有闭合质粒DNA。第五步：纯化DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA2.影响质粒DNA产量的因素（1）受体菌株一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。（2）质粒拷贝数这是直接决定DNA产量的重要因素之一。质粒本身的性质所决定。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。二、基因组或其他DNA的提取1.细菌基因组DNA的制备（1）细胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC温育。不用NaOH!（2）DNA纯化CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。（3）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。哺乳动物细胞基因组DNA的抽提（1）组织粉碎动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。（2）细胞裂解0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50°C温育。（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀DNA用2倍体积的无水乙醇。（5）除去RNA污染从植物组织中制备DNA（1）组织粉碎用液氮冷冻后研磨成细粉末。（2）细胞裂解用2%CTAB/2-ME（十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。65oC温育。（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀DNA用0.6倍体积的异丙醇（-20oC）。（5）除去RNA污染用RNaseA。三、DNA的定量和纯度测定1.紫外光谱法原理：DNA（或RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。用微量比色杯（10“1）在紫外分光光度计直接测定。2.琼脂糖凝胶电泳估计原理：溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发红色荧光。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。四、DNA分子量的估计一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。第二节DNA的凝胶电泳一、电泳的基本原理带电荷的分子在电场中会以一定的速向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：（1）分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。（2）形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关:分子量越大，移动越慢。相同分子量的DNA:（1）闭合环状卷曲超螺旋迁移快，（2）线性分子次之，伸展开环状慢。二、琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来2.琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。四、凝胶染色1.染料溴化乙锭。2.原理EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。第三节核酸的分子杂交DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或1251）标记的DNA或RNA探针。一、Southernblot用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。二、Northernblot用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。三、原位杂交原位杂交对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。第四节基因扩增技术PCR一、基因扩增（geneamplification）指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：环境诱发扩增在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增基因的程序性扩增在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。基因组进化扩增生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。基因工程扩增载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。PCR扩增应用聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术，在体外特异性地扩增某个基因。二、PCR技术PCR的发明PCR技术的原理(1)DNA模板变性95°C双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。(2)DNA模板与引物复性引物(primer):人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。(3)DNA链的延伸DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。(4)1个循环的结果(5)新一轮循环开始PCR的过程(1)第一步变性(denature)94-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。(2)第二步复性(anneal)50-60oC下1分钟，引物优先与模板复性。①引物的浓度高，引物的链短。(3)第三步延伸(extend)72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。(4)第四步变性(denature)94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。(5)第五步重复(repeat)PCR的特点(1)特异性强PCR使用专门合成的DNA引物。延伸过程是在高温下进行。(2)敏感性高需要的模板量极低。(3)快速整个PCR过程约4小时即可完成。(4)简便对模板的纯度要求低。(5)可以扩增mRNA5.影响PCR的因素(1)TaqDNA聚合酶①热稳定性②适温度高Taq酶的功能缺点：不能修复错误的碱基配对！TaqDNA聚合酶的激活剂金属离子敏感(尤其是Mg2+)。(2)其它耐热的DNA聚合酶TthDNA聚合酶无3'~5'DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。VENTDNA聚合酶有3‘一5‘外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受lOOoC高温。PfuDNAPolymerase是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率低的。但PCR产物为平端！TaqPlusDNAPolymerase是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。Taq的PCR产物3'端往往带有一个A。(3)引物(primer)①位置与待扩增的模板DNA区段的两3'端序列互补(5‘端相同)的短DNA。引物的长度理论计算：419=2.75X1011。一般引物设计为长15—30bp。引物的碱基序列3'端必须与模板正确配对，5'端可以不配对。引物的碱基组成尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列.避免形成引物二聚体(dimer)两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。引物的Tm值手工计算：Tm=(G+C)X4+(A+T)X2引物的浓度一般使用终浓度各0.5仇mol/L。简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。套嵌引物(nestedprimers)设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。(4)模板(template)①纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。②模板的量：不能太多，100^1反应体系中lOOng足够。（5）dNTPsdNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmo1/L。浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。（6）Mg2+的浓度所TaqDNA聚合酶要求有游离的Mg2+。以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。一般用1.5-4.5mmo1/L的MgC12终浓度。PCR技术的扩展（1）荧光实时定量PCR（2）反向PCR（3）不对称PCR用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。（4）反转录PCR（RT-PCR）扩增RNA模板。利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA从基因组中扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；微量残留DNA扩增；分析模板序列；（2）基因的体外诱变在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。利用引物的5'端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。（3）基因组的比较研究比较不同物种之间的基因组特征和相似性。第五节DNA序列分析一、双脱氧链终止法1.原理（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的（3）复制反应可以在体外进行。（4）2'和3'双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。2.技术要点。（2）脱氧核糖的连接是以3'-5'磷酸二脂键。（1）制备单链DNA模板，就是待测序的DNA链。（2）制备一小段单链引物（DNA或RNA）需带有放射性或荧光标记。（3）特殊的DNA多聚酶不能有5'-3'和3'-5'的外切酶活性；与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。(4)制备2'和3'双脱氧的ddNTP3.Sanger双脱氧终止法测序过程二、Maxam-Gilbert化学修饰法1.原理末端放射性标记DNA片单链用化学试剂处理，然后在特定的碱基中引入化学基团，DNA在被修饰的核苷酸位置断裂，形成长度只差一个核苷酸的DNA链混合物，之后进行凝胶电泳、放射性自显影，就可以阅读碱基顺序。碱基特异的化学修饰法碱基特异的化学切割法测序过程每组反应只针对特定的碱基，共有4组反应，可分别显示G、A+G、C、C+T的终止位置。特点：读出的序列就是要测的序列。三、DNA杂交测序1.原理只有完全互补的DNA序列才能杂交形成完全的双链分子。杂交效率高。有个别不互补碱基时，杂交效率下降。(3)非互补用一段寡居聚苷酸(8-mer)的所有可能的碱基排列序列作探针。根据杂交效率可推断出靶DNA的序列碱基越多，杂交效率越差。2.技术要点DNA芯片(chip)把寡聚核苷酸探针的3‘端或5'端与玻璃或凝胶形成共价连接。四、DNA自动化测序1.技术要点(1)非放射性标记荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。(2)不同的标记对象既可标记引物，也可标记ddNTP。反应的自动化Sanger脱氧终止法。读片的自动化激光探头直接读胶，实时阅读。(4)分析自动化电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。(5)反应可在一个试管中进行标记ddNTP时。荧光标记引物的自动化测序分别用4种荧光物标记引物，区分反应产物，混合电泳，激光一次读胶，电脑合成结果。荧光标记ddNTP自动测序原理图解第六节酵母双杂交系统一、酵母双杂交系统的作用有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质二、酵母双杂交系统的原理结构域(Domain)合作许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。拆开Domain用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。重组Domain用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。观察报告基因表达通过效应基因是否被激活来检查：在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。如果蛋白A与蛋白B不能相互结合GAL4的DBdomain与ADDomain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。如果蛋白A与蛋白B能相互结合GAL4的DBdomain与ADDomain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。双杂交原理X基因和Y基因产物的相互结产物的相互结合导致reportergenereportergene表达。Reportergene表达就可说明X基因产物于Y基因产物能结合。三、构建双杂交体系的宿主菌删除基因组中的内源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。四、构建报告基因(reportergene)GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。五、构建双杂交体系的穿梭质粒穿梭质粒(shuttleplasmid)既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。双杂交体系需要两种穿梭质粒分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。(1)BD-plasmid靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。(2)AD-plasmid外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后。六、酵母双杂交的实验过程把蛋白A插入到BD质粒上(pGBT9)把蛋白B插入到AD质粒上(pGAD424)两种重组质粒共同转化酵母菌(HF7c)筛选观察(1)存活选择(2)蛋白结合选择第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(Restrictionendonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4—8bp),并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。来源：原核生物。性质：内切酶，即在核酸分子链的内部制造切口的酶。功能：自我保护作用。(1)限制(Restriction)限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。(2)修饰(Modification)Dam甲基化酶Dcm甲基化酶二、限制性内切酶的类型1.I型限制性内切酶识别位点序列：未甲基化修饰的特异序列。切割位点：在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。作用机理：需ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷蛋氨酸)。2.II类限制性内切酶识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列(多数是回文序列)。与DNA的来源无关。切割位点：切开双链DNA。形成粘性末端(stickyend)或平齐末端(bluntend)粘性末端(stickyends，cohensiveends)含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①5'端凸出(如EcoRI切点)②3'端凸出(如PstI切点)粘性末端的意义：①连接便利②5'末端标记③补平成平齐末端(5)同裂酶(Isoschizomers)完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。同尾酶(Isocaudamers)识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。限制酶的酶活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现佳切割能力和位点的专一性。IIs型限制性内切酶：移动切割(shiftedcleavage):在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。3.III类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷蛋氨酸)。三、限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。2•用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR(现在都写成平行，如EcoRI)。如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。限制酶前面要带上R(Restriction)，修饰酶前面要带上M(Modification)。四、影响限制性内切酶活性的因素1.DNA的纯度DNA的甲基化程度温度缓冲液（Buffer）五、限制性内切酶对DNA的消化内切酶与识别序列的结合模式II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。完全消化内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。局部消化只有有限数量的酶切位点被切开。限制酶酶切反应的终止大多数酶可用65°C温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。几种常用限制酶识别位点限制性内切酶识别序列的交叉列表第二节DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase）的发现从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。二、DNAligase的特点两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体的连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。连接条件（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3'端有游离的-0H,5'端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量三、连接反应的机理ATP（NAD+）提供激活的AMP。ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。AMP与连接酶的赖氨酸£-氨基相连。AMP随后从连接酶的赖氨酸£-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。3'-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。四、连接反应的温度最佳温度：连接酶反应的佳温度是37°C。实用温度：但在37C下粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用4~16°C。五、影响连接反应的因素插入片段与载体的浓度比例反应温度第三节DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶二、常用的DNA聚合酶的特点共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3'—0H端。主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。常用DNA聚合酶的特性比较：DNA聚合酶3'一5'外切酶活性5'-3'外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高三、DNA聚合酶在基因工程中的用途大肠杆菌DNA聚合酶I：主要用来制备带放射性标记的DNA探针。大肠杆菌DNA聚合酶I的性质一条单链多肽。5'f3'外切酶活性位于外切酶活性位于NN端。用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5'-3'外切酶活性外切酶活性部分。就成为Klenowfragment。DNA聚合酶I(PolI)的反应条件底物：dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)Mg2+带有3'—OH游离端的引物DNA模板(3)用DNA聚合酶I制备探针核酸探针(核酸探针(probeprobe)能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。探针的标记方式DNADNA聚合酶聚合酶II对探针序列的标记Klenowfragment(1)Klenowfragment的性质具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性。(失去了5'-3'外切酶活性)。(2)主要用途3'端补平DNA3'末端标记③cDNA第二链的合成T4DNA聚合酶（1）T4DNA聚合酶的性质来源：从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。酶活性：有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性（降解单链更快）。特点：当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3'-5'外切酶功能，制造出3'隐蔽端。（2）T4DNA聚合酶的用途补平隐蔽末端②DNA3'末端标记放射性标记的优缺点：优点：制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。缺点：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、对人体有害。要求在专门实验室操作。非放射性标记i）生物素标记ii）地高辛标记iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）酶的作用：催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。iv）用非放射性标记的探针检测原理探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。核酸探针杂交筛选法的缺点是：只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。T7DNA聚合酶（1）来源：从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的。（2）T7DNA聚合酶的特点持续合成能力强3'-5'外切酶活性高不受DNA二级结构的影响（3）T7DNA聚合酶的用途以大分子量DNA为模板的合成进行末端标记补平隐蔽末端修饰后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除3'-5'外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7DNA聚合酶的用途DNA测序双脱氧法。标记DNA3'隐蔽末端更有效地补平末端6.逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶(RNA指导的DNA聚合酶)。来源：RNA肿瘤病毒。(2)AMV的性质a链有反转录活性和RNaseH活性。P链RNA-DNA杂交双链中5'~3'DNA外切酶活性。逆转录酶的用途合成cDNA合成DNA探针RT-PCR用的模板第四节DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶来源：小牛胸腺。组成：大小两个亚基。特性:需要3'—OH、二甲胂酸缓冲液。不需要模板！底物可以是单链DNA、是3'—OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。末端转移酶的用途同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。(2)再生酶切位点，便于回收克隆片断。非放射性标记DNA片断的3'端催化非放射性标记物参入DNA片断的3'端。(生物素-11-dUTP等)二、T4多核苷酸激酶来源T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。功能催化Y磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5'-OH端。多核苷酸激酶的用途DNA5'-OH端磷酸化标记DNA的5'端三、碱性磷酸酶碱性磷酸酶种类(1)细菌性碱性磷酸酶(2)小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA(或RNA)5'端的磷酸根。碱性磷酸酶的功能防止线性化的载体份子自我连接第五节核酸外切酶(Exonucleases)是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。一、单链DNA外切酶大肠杆菌核酸外切酶I(exoI)5'~3'外切(识别5'-OH)大肠杆菌核酸外切酶W(exoW)5'~3'、3'-5'外切(识别3'-0H、5'-P)二、双链DNA外切酶核酸外切酶111(exoIII)3'-5'外切(识别3'-OH)主要用途：在DNA双链的末端产生出单链区域。入核酸外切酶(入exo)5'~3'外切，识别5'-P(但不能降解5'-OH)主要用途：使DNA双链变成单链(短)3.T7基因6核酸外切酶5'~3'外切。既能识别5'-P,又能识别5'-OH。用途与入exo一样。第六节单链DNA内切酶一、S1核酸酶来源:稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)。特性(1)高度单链特异性(2)反应条件①低水平Zn2+②pH4.0〜4.3S1核酸内切酶的功能(1)催化单链RNA或DNA降解。切掉双链核酸中的单链区。降解限制酶切形成的单链突出端。不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链.S1核酸酶的用途(1)定位RNA用mRNA测定基因中的外显子序列二、Bal31核酸酶来源:埃氏交替单胞菌(Alteromonoasespejiana)功能:既有单链特异的DNA(RNA)内切酶；又有双链特异的DNA外切酶。反应条件:Mg2+、Ca2+Bal31的用途:定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。Bal31控制消化法:用Bal31消化线性DNA，并在不同的时间加入EGTA终止反应，再酶切电泳。与对照组(不用Bal31消化)只用相同的酶切的电泳比较。根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原DNA中的位置。分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。分别用原内切酶切后电泳，判断片断数目和大小。第三章第三章基因工程载体载体(Vectors)：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。基因工程对载体的要求在宿主细胞内能独立复制。(2)有选择性标记。(3)有一段多克隆位点。(4)分子量小，拷贝数多。(5)容易从宿主细胞中分离纯化。载体的种类质粒(plasmid)单链DNA噬菌体M13久噬菌体的衍生物柯斯质粒(cosmid)动物病毒(virus)第一节质粒载体一、质粒(plasmid)是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。质粒的一般生物学特性分子小：1—200kb编码基因少：2—3个中等大小的蛋白质。(3)环形状：双链环状DNA。(4)质粒的空间构型：共价闭合开环DNA(opencircular，ocDNA)线形DNA(linear，lDNA)(5)质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA快、1DNA次之、ocDNA慢。二、质粒的类型接合型质粒:能自我转移非接合型质粒：不能自我转移接合型质粒：又叫自我转移型质粒。除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。非接合型质粒：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。R质粒(抗性质粒)：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状(resistance)。Col质粒：带有控制大肠杆菌素(colicin)合成的基因。三、质粒的复制类型严紧型质粒(stringentplasmid)拷贝数少，只有1—3份拷贝。松弛型质粒(relaxedplasmid)拷贝数多，有10—60份拷贝。四、质粒载体的构建天然质粒的局限性(1)分子量大，拷贝数低(2)筛选标志不理想质粒载体必须具备的基本条件(1)具有复制起点(ORI)(2)具有抗菌素抗性基因若干限制性内切酶的单一位点具有较小的分子量和较高的拷贝数。质粒的选择标记及其工作原理：(1)选择标记抗菌素抗性氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)抑菌原理：通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。细菌抗性原理：Ampr基因编码0-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的0-内酰胺环。氯霉素()氯霉素(cchlorahlorammphenicophenicoll，，CmlCml))a)抑菌原理：通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌生长的细菌。b)细菌抗性原理：Cmlr编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。卡那霉素(kankanamycinamycin，，KanKan)杀菌原理：通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。细菌抗性原理：Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。Iv)链霉素(StrStreptomycineptomycin，，StrStr)杀菌原理：通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。细菌抗性原理：Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。v)四环素(TetTetracyclineracycline，TetTet))抑菌原理：通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。细菌抗性原理：Tetr编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因。抗菌素选择原理不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基(选择培养基)中生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体（2）低拷贝数的质粒载体（3）失控的质粒载体runawayplasmidvectors（4）插入失活型质粒载体（5）正选择的质粒载体Directselectionvectors（6）表达型质粒载体表达载体的结构1）普通载体元件复制起始点ORI选择标记多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区五、经典的大肠杆菌质粒载体pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型：天然质粒，属低拷贝型。（2）长度：9.09kb。（3）选择标记：四环素抗性Tetr（4）克隆位点：6个克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI（主要使用EcoRI）ColE1（1）类型：天然质粒，属高拷贝型。（2）长度：6.3kb。（3）选择标记：大肠杆菌素（colicin）E和对El、免疫的基因（immEl）（4）克隆位点：EcoRI（5）ColEl的选择缺陷用对外源colicinEl的免疫性和自身不能合成colicinEl作选择，操作非常繁杂。对colicinEl敏感的细菌群体中自发突变产生抗colicinEl的频率很高！pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。（1）元件来源复制起点ori：pMBl系列（来源于ColEl）的高拷贝型复制起点Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因Tetr基因：pSC101的Tetr基因（2）长度：4363bp（3）选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点：24个克隆位点。（5）pBR322的优点双抗菌素抗性选择标记分子小，克隆能力大高拷贝数安全（6）pBR322pBR322的缺点保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！（7）PBR322的改进删除mob识别位点改造EcoRI位点pUCpUC系列：UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。（1）元件来源复制起点：pBR322的oriAmpr基因：pBR322的Ampr基因（但其上失去了克隆位点）lacZ的启动子：大肠杆菌lacZ'基因：大肠杆菌lacZ的a-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。（2）长度：约2.7kb（3）克隆位：10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ'基因的5'端。（4）选择标记Ampicillin抗性和lacZ的a肽互补（蓝白斑）相结合。（5）pUCpUC系列载体的优点系列载体的优点更小的分子量选择方便克隆便利测序方便六、其它质粒载体pGEM-3Z:由pUC派生而来。PGEM-3Z的特点：如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA外源基因正接反接都可以转录。MCS与pUC18的完全一样。pGEM-4Z：与pGEM-3Z相同，只是T7启动子和SP6启动子的位置互换。穿梭质粒载体（shuttleplasmidvectorsshuttleplasmidvectors）（1）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。（2）常用的穿梭质粒载体大肠杆菌一枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌—酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌f动物细胞穿梭载体（3）穿梭载体的优点利用大肠杆菌进行基因克隆、表达也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。七、质粒载体的不稳定性质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中。质粒分配方式（1）主动分配：天然质粒（2）随机分配：人工质粒分离的不稳定性（segregationinstability）在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并终繁殖成无质粒的优势群体。结构的不稳定性（structuralinstability）寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。影响质粒载体稳定性的主要因素（1）新陈代谢负荷：复制负荷转录和翻译负荷（2）质粒载体的拷贝数是产生无质粒细胞的重要原因。（3）寄主菌的重组体系含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。第二节噬菌体载体一、噬菌体的一般特性噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。二、噬菌体的生活周期溶菌周期：烈性噬菌体（virulentphage）感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。溶原周期：温和噬菌体（temperatephage）感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization）。整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。三、单链噬菌体载体单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13、fd1、fd噬菌体单链DNA噬菌体的特点（1）+DNA。（ssDNA）（2）复制型（RF）是双链环状DNA。（3）RFDNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。并产生噬菌斑。（4）不存在包装限制。（5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。M13噬菌体（1）寄主：M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。但M13DNA可以转染雌性大肠杆菌。(2)DNA长度：6407bp。DNA提纯：RFdsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。成熟的噬菌体里只包装有+DNA，也容易提取。(4)M13的生活周期M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA-+DNA合成一DNA,形成RFdsDNAf—DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白一组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞(5)没有包装限制M13载体的构建：克隆区域的选定(2)加入酶切位点(3)M13载体系列M13载体系列的命名对M13mp1的改进对M13mp2的进一步改进M13系列载体的优点有MCS，便于克隆不同的酶切片段Xgal显色反应，可供直接选择无包装限制，克隆能力大可以克隆双链DNA分子中的每一条链M13载体的缺点插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降实际克隆能力小于1500bp。噬菌粒载体(phagemidphagemidvectorsvectors)由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。噬菌粒载体的特点分子量小克隆能力大两种复制形式既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。(3)pUC118/pUC119构成1)M13的基因间隔区(IG)带有M13复制起点。2)pUC18/pUC19质粒载体：质粒复制起点AmprlacZ'MCSpUC118/119的复制模式双链质粒复制模式单链滚环噬菌体复制模式噬菌粒载体的包装(4)pBluescript噬菌粒载体(pBS)组成由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制起点和T3、T7噬菌体的启动子组成。②特点1）定向体外转录MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体RNA聚合酶，就可以定向体外转录。2）两种复制模式既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。3）选择方便有Ampr和lacZ',可以进行Amp抗性选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择。4）插入方便18个单一酶切位点的MCS③常用的pBluescript载体（5）PCR产物克隆载体T载体结构：pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。特点：MCS的中部已经切开，各有一个3'端突出T。噬菌体展示载体（Phagedisplayvector）（1）噬菌体展示（Phagedisplay）将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。（2）噬菌体展示载体的构建把外源DNA片断插入基因III的序列前端，并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。四、双链噬菌体载体一入载体入DNA分子的特点（1）长度为48502bp；（2）双链线性DNA；（3）但在两端有cos位点，可以环化。入噬菌体的基因组特点入DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。入DNA的复制模型（1）0型复制（2）滚环复制入噬菌体载体的构建（1）构建原理：删除入噬菌体的非必需区，留出插入空间。（2）构建过程在这个非必须区内制造限制酶切点引进某些突变表型，作为选择标记突变某些基因，使它成为安全载体删除入DNA必须区段上常用的限制酶切点（3）人工构建的入噬菌体载体有两种类型：①插入型载体（insertionvectors）②替换型载体(substitutionvectors)入载体的筛选标记置换型载体可取代片断中如果包含LacZ'可用Xgal显色作筛选标记。插入型载体根据插入所引起的表型突变。入载体的体外包装(1)体外包装：在试管中与入噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。(2)体外包装过程入噬菌体外壳蛋白的合成E基因：入的E基因编码头部蛋白的主要成分(占头部总蛋白的70%)。D基因：入的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与入DNA进入头部和头部的成熟有关(只占20%)。体外包装存在的问题包装错误重组体外包装的容量限制入DNA载体的优点比一般的质粒载体的容量大的多。cosmidcosmid载体(粘粒)(1)大小：4-6kb(2)组成入DNA：cos序列和控制包装的的序列。PBR322:质粒的复制子、抗药性基因、几个限制性酶的单一位点(3)cosmidvector的特点具有入噬菌体的特性具有质粒载体的特性方便的选择高容量的克隆能力(5)cosmidcloning应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组DNA技术，叫“柯斯克隆"(cosmidcloning)。①理论依据：cos位点:：包装识别。“多联体”复制：入噬菌体的生命周期中，会产生数百个入DNA通过cos位点连接的“多联体”分子。Ter体系：在包装的时候，入噬菌体具有位点特异的末端酶(terminase)体系(Ter体系)，识别cos位点，把多联体切成单个入DNA长度。包装限制：两个cos位点之间，必须保持38—45kb的DNA，Ter体系才能识另I」。(6)cosmid克