青藤碱对肾移植大鼠静脉血白细胞介素6的影响

青藤碱对肾移植大鼠静脉血白细胞介素6的影响

0morphenan-b-一个青藤碱是中医科植物青凤藤紫铜碱的一种非小细胞。从etwils中提取的碱性单体通常是其盐酸盐。其化学名为morphinan-b-one,7,8-didehydro-4-hydroxy-3,7-dimethoxy-17-methy(9X,13X,14X),其分子式为C19H23NO4,相对分子质量为329.38。在化学结构上,由氢菲核及胺桥组成,结构类似吗啡,其化学结构式为:实验选用近交系大鼠F344,Wistar为实验动物,采用同种异体原位肾移植的方法,建立肾移植急性排斥反应的动物模型和同基因移植的动物模型。通过观察青藤碱对肾移植急性排斥反应时静脉血白细胞介素6质量浓度以及移植肾组织学的影响,进一步分析青藤碱免疫抑制作用在细胞学水平、分子水平上的作用途径。1肾移植组织中细胞的移植设计:随机对照动物实验。时间及地点:于2008-03/2009-03在广州医学院第二附属医院外科实验室完成。材料:选择近交系F344大鼠60只,体质量200~250g,雌雄各半,购自中山大学医学院实验动物部;近交系Wistar大鼠80只,体质量250~300g,均为雄性,购自中科院上海实验动物中心。实验过程中对动物处置方法符合动物伦理学要求。主要药物及试剂:方法:动物模型的建立:以Wistar大鼠为肾移植受体,以F344大鼠为肾移植供体。供肾的切取:游离供肾血管和输尿管膀胱,行原位灌注。灌注满意的标志:肾脏和附属血管完全苍白。然后,切断远、近心端腹主动脉、下腔静脉,切下输尿管连带部分膀胱壁。置供肾于4℃的HCA的液中保存。供肾的修整:在4℃的HCA液中修剪供肾动、静脉、输尿管及膀胱,将连续于肾动脉的腹主动脉修剪成一3mm×2mm的椭圆形动脉瓣,中心为肾动脉开口,将供肾静脉根部从下腔静脉上离断。在同侧输尿管末端相连的膀胱壁上修剪出Φ3.0~4.0mm的膀胱瓣,瓣中心为输尿管开口。肾脏原位移植:切除双侧肾脏,保留左侧肾脏的动脉、静脉的残端。肾静脉-原左肾静脉残端端-端吻合,肾动脉-腹主动脉端-侧吻合,输尿管膀胱瓣与受体膀胱行端侧吻合。实验分组及处理:F344→Wistar移植方式的受体大鼠按照同期随机的原则分为4组,每组12只。生理盐水组给予生理盐水,3mL/(kg·d),腹腔注射,1次/d;青藤碱组给予青藤碱30mg/(kg·d),腹腔注射,1次/d;环孢素A组给予环孢素A2.5mg/(kg·d),腹腔注射,1次/d;青藤碱+环孢素A组给予青藤碱30mg/(kg·d)+环孢素A2.5mg/(kg·d),腹腔注射,1次/d。另选择12只Wistar大鼠不做任何处置,作为对照组。白细胞介素6的检测:肾移植后第7天,从各组随机抽取6只受体鼠处死后,取下腔静脉血。应用酶联免疫吸附法检测静脉血白细胞介素6的质量浓度。(1)所有吸光度值(A)都应减去空白值后再行计算。(2)以标准品1000,500,250,125,62.5,32,16,0ng/L,A值在半对数纸上作圆,绘制标准曲线。(3)根据样品A值在标准曲线上的位置,查出大鼠静脉血白细胞介素6的质量浓度。病理改变及排斥反应组织学分级:在肾移植后第7天,处死受体鼠,留取移植肾组织,甲醛固定并行切片和石蜡包埋。评分和分级:0分:形态结构正常或临界级(轻度肾小管炎);1分:Ⅰ级,中度肾小管炎;2分:ⅡA级,重度肾小管炎;3分:ⅡB级,轻中度动脉炎;4分:Ⅲ级以上,重度内膜性动脉炎;重度内膜性动脉炎伴有透壁坏死性动脉炎;中层平滑肌坏死。病理改变的评分,以移植肾切片中可发现的最高分级的病变为标准(病理分级采用Banff97标准)。主要观察指标:大鼠静脉血白细胞介素6的质量浓度,依据Banff97标准对急性排斥反应病理改变分级评分。设计、实施、评估者:实验设计、实施、评估均为本文作者,均经过正规培训,采用盲法评估。统计学分析:实验资料由本文作者应用SPSS10.0统计软件包处理,数据以表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05表示差异具有显著性意义;不同指标间采用one-wayANOVA方差检验。2结果2.1动物的数量分析建立近交系大鼠F344→Wistar的肾移植动物模型48对,共分为4组,全部进入结果分析,无脱失。2.2青藤碱或/和环孢素a对降低细胞介素6的质量浓度具有因果关系青藤碱组、环孢素A组、青藤碱+环孢素A组受体鼠的血白细胞介素6质量浓度均显著低于生理盐水组[(315.37±56.90,300.35±34.45,66.98±45.06,750.92±93.70)ng/L,P<0.05],说明应用青藤碱或/和环孢素A对降低白细胞介素6的质量浓度存在确切效果;青藤碱组与环孢素A组差异无显著性意义(P>0.05);青藤碱+环孢素A组显著低于青藤碱组、环孢素A组(P<0.05),提示青藤碱与环孢素A在降低急性排斥反应时白细胞介素6的质量浓度上存在协同效应。2.3肾急性排斥反应时组织学改变如表1所示,青藤碱组、环孢素A组、青藤碱+环孢素A组受体鼠移植肾的病理评分均显著低于生理盐水组(P<0.05),说明应用青藤碱或/和环孢素A均可减轻移植肾急性排斥反应时组织学改变;青藤碱组与环孢素A组差异无显著性意义(P>0.05);青藤碱+环孢素A组受体鼠移植肾的病理评分显著低于青藤碱组、环孢素A组(P<0.05),提示青藤碱与环孢素A在降低急性排斥反应时移植肾组织学改变上存在协同作用。3讨论3.1肾灌注及肾动脉瓣本实验在刘定益等的大鼠同种异体原位肾移植方法基础上进行改进。在取肾时游离双侧肾脏及腹主动脉、下腔静脉,避免损伤供肾的动、静脉;在修肾时,依据血管条件而选择动静脉的留取方式和供肾,提供了条件更佳的供肾,提高了移植的成功率;完整游离输尿管及开口区的膀胱瓣,尽量保证了输尿管的血供。取肾时采用原位灌注的方法,缩短了供肾的热缺血时间;灌注液使用0~4℃的HCA液,减轻了肾脏的间质水肿,降低了急性肾小管坏死的发生率,有利于移植肾功能的恢复。在植肾操作时,结扎了移植区段回流到下腔静脉的腰背静脉分支,避免了在血管吻合过程中少量静脉血的回流而造成凝血;采用肾动脉瓣与腹主动脉端侧吻合,减少或避免了肾动脉狭窄的发生;供肾静脉与原左肾保留的肾静脉蒂相吻合,利用下腔静脉小切口插入支架管辅助缝合,避免了因为静脉壁薄而撕裂;相吻合的静脉血管管径基本相同,减少或避免了吻合后发生漏血。因此,在改进了手术方法后,显著提高了实验动物模型建立的成功率,为本实验的成功奠定了良好基础,并保证了实验结果的可靠性。3.2青藤碱对白领介素6活性的影响青藤碱是从防已科植物青风藤中提取的生物碱单体,具有镇静、镇痛、镇咳、抗心律失常、抗炎和免疫抑制等药理作用,临床上主要用于对类风湿性关节炎等各种风湿病的治疗。近年来对其抗排斥作用的研究逐步深入,有关青藤碱的抗排斥作用也有不少报道。在大鼠肾移植模型中发现,可显著延长受体存活期,并证实其与环孢素A有协同作用。白细胞介素6主要由激活的T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等细胞分泌,是参与细胞介导的移植物损伤的重要细胞因子。其可能的作用途径为:(1)在抗原识别与递呈阶段,抗原递呈细胞(APC)将抗原提取、加工,并以肽抗原的形式递呈给Th细胞。(2)Th细胞被激活后产生多种细胞因子包括白细胞介素1、白细胞介素2、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等。(3)白细胞介素2可以诱导白细胞介素6mRNA的合成,而肿瘤坏死因子α、β-干扰素等也可刺激白细胞介素6的进一步产生,起到正调节作用。(4)促进B细胞的激活、增殖和分化,并促进成熟的B细胞产生免疫球蛋白。(5)促进T细胞的增殖和分化,尤其是促进了细胞毒T细胞的增殖和分化。(6)可促进T细胞产生白细胞介素2及其受体的表达增强。由此可见,白细胞介素6不仅直接促进了T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活、增殖与分化,同时也促进了其他淋巴因子的分泌,使移植免疫排斥反应的损伤加剧。急性排斥反应发生时,移植物中存在免疫细胞浸润,白细胞介素6基因表达增加,局部组织及血、尿中白细胞介素6表达水平升高。对血、尿白细胞介素6活性进行动态观察,在诊断急性排斥反应及评价抗排斥反应的疗效方面具有重要的临床意义。白细胞介素6可协同白细胞介素4,白细胞介素5,促使静止的B细胞转化为能分泌抗体的浆细胞;增加白细胞介素2等细胞因子的产生;参与调节在免疫与炎症反应中发挥重要作用的不同成分;激活T细胞;促进T细胞增殖、促进细胞毒性T细胞(CTL)的分化,增强自然杀伤细胞活性。在急性排斥反应时,移植肾内浸润的Th细胞产生白细胞介素6的能力显著增高,移植肾组织及细胞可产生白细胞介素6。肾小管细胞被证实在受刺激后能够合成白细胞介素6,移植肾组织活检时可检测到高水平的白细胞介素6mRNA,在移植物浸润细胞中,能产生白细胞介素6细胞的比例也明显升高。而影响白细胞介素6产生水平的主要因素为HLA的相容性程度。Casiraghi等提出,24h内白细胞介素6水平升高1倍可提示急性排斥反应的发生,该指标诊断的敏感性为87%,特异性为64%。白细胞介素6的表达水平与移植物的损伤程度存在一致性。尸体供肾中白细胞介素6的水平高于活体供肾,故尸肾移植后急性排斥反应的发生率也相应增高。本实验在大鼠肾移植模型上观察青藤碱对白细胞介素6的影响。青藤碱组与