第五章 亲和层析

第五章亲和层析第一节亲和层析基本原理第二节亲和层析操作第三节亲和层析应用第一节亲和层析基本原理亲和层析定义亲和层析是通过生物分子之间特异可逆结合与解离的原理，进行生物分子特异分离的层析技术。在1968—1972年Anfinsen创建了亲和层析技术。20世纪70年代有了惊人的发展，并逐步得到广泛的应用。目前，已有活化载体及其衍生物产品出售，使得亲和层析变得更简捷。亲和层析发展过程亲和层析优点其他方法利用理化性质的差异，许多分子差异很小，要得到纯度高的单一分子，要联合运用多种方法，最终得率低；而亲和层析迅速、简单、高效、特异。要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固相载体之后方可进行。亲和层析缺点亲和层析原理生物分子之间特异性结合抗原－－抗体激素－－受体酶－

－底物、底物类似物、抑制剂、辅基核酸－－互补链第二节亲和层析操作载体配基一、载体的选择理想的载体应满足下面的要求：具有较好的物理化学稳定性较多的活性基团能够和配体稳定的结合结构为均匀的多孔网状结构与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附

亲和层析常用的载体纤维素葡聚糖琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶多孔玻璃珠目前应用最多的是Sepharose4B，是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，基本能符合理想载体的要求。优点缺点纤维素价格低、活性基团较多非特异性吸附强、稳定性和均一性较差葡聚糖稳定性较好孔径较小、稳定性不好聚丙烯酰胺同上同上琼脂糖非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化多孔玻璃机械强度好，化学稳定性好活性基团较少、对蛋白质有较强的吸附作用二、配体的选择可选择的配体有抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似底物、抗体；其他物质，如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金属离子。配体的分类特异性配体只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体

如：抗原和抗体、酶和它的抑制剂通用性配体特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体如：凝集素可以结合各种糖蛋白与基质稳定的共价结合自身应具有较好的稳定性与待分离的物质有适当的亲和力与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性优良的配体须具备的条件配体待纯化的蛋白质配体待纯化的蛋白质抗原特定单克隆抗体或多克隆抗体肝素凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、DNA聚合酶单克隆抗体特定抗原胆固醇胆固醇受体、胆固醇结合蛋白蛋白质A/蛋白质G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸结合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶核苷酸核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶磷酸磷酸酶苯基硼酸盐糖蛋白三嗪染料脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素凝集素糖蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶蛋白质亲和层析中的合适配体三、亲和吸附剂的制备溴化氰活化法环氧乙烷基活化法

指通过对载体进行一定的化学处理，使载体表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。1、载体的活化溴化氰活化生成亚胺碳酸活性基团，可以和含有伯氨基(NH2)的配体反应，生成异脲衍生物缺点：非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。与配体结合不够稳定溴化氰有剧毒、易挥发，操作不便。

环氧乙烷基活化

生成含有环氧乙烷基的活性基团，可以结合含有伯氨基(NH2)、羟基(OH)和硫醇基(SH)等基团的配体优点不引入电荷基团，与配体形成的N－C、O－C和S－C

键都很稳定，使用寿命长

缺点与配体偶联时需要碱性条件，温度为20~40℃，对于一些比较敏感的配体可能不适用以溴化氰偶联法为例，包括步骤：活化偶联配体结合量的计算1．活化基质在一定量的贮存载体Sepharose4B(即用布氏漏斗抽干的胶)中，加入等量的蒸馏水和2mol／LNa2C03溶液(pH11~12)，混匀。另将称量的固体CNBr(50~300mg／g贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼脂糖悬浮液内进行活化，其pH值始终维持在11~12之间。接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用10~20倍凝胶体积的冷水及0.07mol／LNaHC03溶液(pH8.5)洗涤。

通过活化反应形成的化合物可能有两种：其一是具有反应能力的亚氨碳酸盐衍生物；其二是无反应能力的氨基碳酸盐。2．偶联

配体和基质充分偶联而形成固相载体。

经活化和洗涤过的基质与等体积的0.2~0.25mol／L碳酸盐缓冲液(含0.5mol／LNaCl和1~10pmol配体／ml基质溶液)混合，缓慢搅拌(勿用磁力搅拌器)2h(室温)或过夜(4℃)，以便配体和基质充分偶联而形成固相载体。

3．配体结合量的测定配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶结合配体的量表示的。如用mg/ml表示。测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量的参数。具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。(1)直接测定法①2，4，6—三硝基苯磺酸钠的颜色试验

②根据配体的特性进行测定(2)间接测定法

①推算法一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。

②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量其方法有：一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质，然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子物质的量，计算出配体的结合量。二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，根据上样量即可推算出配体的结合量。

四、特异性吸附当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层柱时，欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零；当样品开始进入柱中时，配体和欲