电泳+DNA体外重组技术1st

DNA体外重组技术

生物化学与分子生物学研究所概念

是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将

重组分子转入受体细胞，并筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增，成为克隆。步骤

1.分离或合成感兴趣的目的基因及载体分2.构建、改造作为载体的DNA切3.目的基因与载体DNA在体外重组接4.重组DNA引入受体细胞转5.阳性重组子的筛选、鉴定、扩增筛replicationtranslationtranscriptionreplicationtranscriptiontranslation一、目的基因的获得

1.从染色体DNA中直接分离2.人工合成3.由mRNA逆转录合成cDNA4.从基因组文库中筛选目的基因5.PCR获得二、载体的选择

1.能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA

片段一同扩增；2.有合适的限制性酶切位点便于进行克隆；3.有一定的筛选标记，易于识别和筛选；4.载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制；5.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件；6.生物安全性好。。

可将外源DNA携带进入宿主细胞的DNA称为载体。常用载体质粒病毒

噬菌体三、连接

用DNA连接酶将目的基因与载体连接

重组子。EcoRIEcoRI四、转化把以质粒为载体的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程称转化。以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程称转染。接受了重组DNA的受体菌称为转化子或重组体。转化的方法感受态细胞及其特点注意事项五、筛选

在转化过程中,并非每个宿主细胞都被转化；即使获得转化的细胞,也并非都含目的基因，可能含有自身成环的载体分子、一个载体与两个外源DNA形成的重组子、或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。因此转化后须在不同层次,不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。Pseudo-positivepositive(一)根据重组子的遗传学特性筛选(平板筛选)1.插入失活

2.插入表达

3.营养素依赖表型

4.α-互补(蓝白斑筛选法)(二)限制酶图谱筛选(电泳筛选法)(三)核酸杂交筛选(四)免疫化学筛选筛选方法分子生物学实验安排第一次实验：质粒提取、鉴定（pGEX-2TK-SP1

/pUC18）。第二次实验：酶切质粒，回收目的片段，将目的基因与载体连接。第三次实验：制备感受态，重组质粒转化E.coli及表型筛选。质粒概念：细菌染色体之外、能够独立复制、可赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA。特性:

双链、闭合环状DNA，1-200kb；常含有编码某些酶的基因。分型：严紧型与松弛型。构型：超螺旋型SC结构致密跑得快电泳时最快。开环型OC体积最大,不易从胶孔中穿过。线型LC居中。分离:将质粒与细菌的染色体DNA、RNA、蛋白等分离。

碱裂解法、煮沸法、去污剂法等。实验一质粒DNA的提取碱裂解法抽提质粒DNA的原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

分子大小构型pH12.6pH4.8质粒DNA小环状变性不完全复性染色体DNA大环状完全变性不能复性操作流程质粒提取见实验教材p89质粒鉴定琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBRGreenI)加样：质粒+上样缓冲液混匀电泳结果观察：UV灯下电泳技术电泳的基本原理带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。是生化与分子生物学的重要研究方法之一，可用于样品分离、物质纯度分析和分子量的测定等。一.定义带有电荷的生物分子在电场作用下可发生移动。由于混合物各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同，在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。二.基本原理在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。

-+泳动度设一带电粒子在电场中所受的力为F，则

F=QE（Q为粒子所带电荷，E为电场强度）根据Stoke定律，一球形分子在溶液中运动所受的阻力F’为：F’=6πrηv（v为分子移动速度；r为分子半径；η为介质黏度）

当分子达到动态平衡时，

F=F’

即QE=6πrηv

移项得v/E=Q/6πrηv/E表示单位电场强度时粒子运动速度，称为迁移率，也称电泳速度，以表示。因此上式也可表示为：

=Q/6πrη

从上式可得到以下结论带电粒子在电场中的移动与:

粒子大小有关，颗粒直径愈小愈快粒子的电荷有关，电荷愈多愈快粒子的形状有关，愈接近球形愈快三、影响迁移率的因素1.电场强度电场强度是指每厘米的电位降凝胶两端距离20厘米，电压降200伏特，电场强度为10伏特/厘米电场强度越高电泳速度越快2.溶液的PH值

PH值决定带电颗粒的解离程度，决定物质所带净电荷的多少3.溶液的离子强度缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢一般在0.02-0.24.电渗现象在电场中液体对固体支持物的相对移动纸或纤维素带负电荷，使其接触的水溶液带正电荷，向负极移动。应尽量避免选用有电渗作用的支持物四、电泳的分类按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。支持物物理性质:滤纸及其他纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、粉末电泳、线丝电泳支持物装置形式分类：平板式电泳、垂直板式电泳、连续电泳、圆盘电泳按pH的连续性分类：连续pH电泳、非连续pH电泳琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acry-lamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis