碱洗法检测加合物

碱洗法检测加合物

海洋是人类的摇篮，是人类的未来。随着海洋的不断开发和利用，大量污染物进入海洋。一些污染物或其中间代谢可能直接或间接地影响特定类型的海洋遗传物质，导致不同类型的dna损伤。这不仅危害了生物群的现代，而且严重影响了个体的繁殖和补充，对海洋生态系统产生了潜在的威胁。为了正确、快速检测这些影响，许多科学家投入了大量精力，开发了一些方法来研究海洋dna损伤。例如，在32p后标记法、碱洗法、单车微凝胶电泳（scgo）、姐妹染色体交换和微核实验等方面。在本文中，简要介绍和比较了上述方法。132dna加合物检测进入生物体内的亲电性化合物或其代谢产物可直接与生物大分子如蛋白质和核酸等形成共价结合的化合物.DNA加合物一旦逃避了DNA自身修复就可能成为化学致癌、致畸、致突变的最小因子.事实上,任何能够形成DNA加合物的化合物,无论形成量的多少,都应认为该化合物具有潜在的致癌和致突变的毒性.所以,DNA加合物的检测,不仅可以监测具遗传毒性化合物的存在,还可以提供有关该化合物的生物效应和潜在危险的信息.1.1化和化聚乙二醇v/v:4-da,v/v细胞或组织匀浆后分别用蛋白酶K和RNA酶(RNase)消化以去除蛋白质和RNA,然后依次用饱和酚、氯仿/异戊醇(V/V:24/1)抽提DNA.该方法快速、基本无蛋白质和RNA污染,且有较高的得率(1~2ugDNA/mg肝组织).1.2除正常核苷酸将DNA在一定的条件下酶切为具3′-单磷酸的正常核苷酸和加合物.可用两种方法提高加合物的相对浓度.一种是用P1核酸酶除去正常核苷酸;也可用n-丁醇抽提DNA.这两种技术针对较大量DNA样品(0.2~60μg)时都可以提高检测方法的灵敏性.n-丁醇抽提法与P1核酸酶法相比不受加合物化学性质的影响,更适合于检测暴露于复杂污染环境中生物体内的DNA加合物.但是,在分析由低分子量化合物所形成的加合物时,这两种技术都不适用.1.33-32p、3-2p、5二磷酸盐的合成在T4多核苷酸激酶的催化下,[Y32P]ATP的末端磷酸根(有放射性标记的)被转移到3′-单核苷酸的5′端,使之成为带放射性标记的[5′-32P]-3′,5′二磷酸盐.1.4dna加合物和正常核苷酸将样品点在ODS-TLC(吸附薄层色谱)板上,利用DNA加合物和DNA正常水解物色谱性能的差异分离加合物和正常核酸.不同的DNA加合物采用PEI-TLC(阴离子交换薄层色谱)板分离分辨.将展开好的PEI板放射自显影制成加合物的指纹图,液闪计数法计算出加合物的浓度.1.5回复突变试验和回收剂对b[a]p的浓度和污染物浓度的检测由于32P后标记法具有灵敏度高(1加合物/(109~1010)正常核酸)、不用事先制备标样等诸多优点,在生物DNA损伤研究领域已得到广泛应用.Canova和Degan等几个实验室于1998年的合作研究中,将地中海贻贝暴露于0.5×10-12~1000×10-12浓度范围的B[a]P中.结果发现,在1000×10-12浓度组,DNA加合物的量随鳃和消化腺组织内B[a]P的剂量显著上升:从0.054加合物/10(8)碱基增加到0.789加合物/10(8)碱基.而DNA氧化损伤(以8-0HdC的量表示)和CYP1A免疫蛋白的量与污染物剂量之间的关系则更为复杂.Harvey和Lyons在现场监测中,分别从污染程度不同的两个海区取比目鱼(Limandalimanda)测定加合物的形成,结果的生物学和统计学意义均很明显.说明了DNA加合物的量与沉积物中污染物的量具有很好的相关性.以上实例均表明32P后标记法检测DNA加合物在定性和定量遗传毒性物质污染方面具有极大应用潜力.2碱解链法研究的dna完整性碱解旋技术是依据在一定的pH值和温度条件下,DNA双链的解旋发生在DNA分子内单链断裂的部位这一性质而建立的.经过一段时间的碱解旋后,溶液中双链DNA分子的量与反应前DNA分子中单链断裂的数目成反比.该方法经过不断改进,已广泛用于分析海星、鲽、鲑以及贻贝、牡蛎等的DNA完整性(integrity).如为了评价北海的污染状况,Everaarts和Sarkar采用时间-依赖的部分碱解链法研究了海星的DNA损伤.依据海星DNA完整性的不同,可将所研究海域分为以下三种类型:1)高度污染海区(近岸和河口地区),DNA完整性较低:27%~43%;2)中度污染海区(远岸区),具中等完整性:49%~64%;3)轻度污染海区(靠近Doggerbank区),DNA完整性较高:70%~87%.下面介绍一种简化的技术.(1)细胞超声时测定细胞时间将细胞在一定温度的暗环境中碱性处理一定时间.细胞经极短时间超声处理后(10s),加入浓度为0.02~0.03mol/L的碱性溶液,置-20℃冰冻过夜.(2)dna淋洗液的制备柱子为一个5mL注射器外筒,羟基磷灰石(HAP)填柱,柱高约1cm.先用0.012mol/LNa3PO4缓冲液冲洗柱子使其均匀.将柱子置于50~60℃的恒温铝质器上.加入5mL样品后,先用0.12mol/LNaH2PO4缓冲液(pH=6.8)淋洗,收集淋洗液(内含单链DNA);再用0.4mol/LKH2PO4缓冲液淋洗,收集淋洗液以获取双链DNA片段.(3)断裂dna比的测定在淋洗液中加入三氯醋酸沉淀DNA,过滤收集DNA于GF/C滤纸上,测试前用OptiscintT闪烁液彻底浸泡滤纸,在闪烁计数器上计数分析单体断裂DNA的百分比.3dna损伤的检测碱洗提技术是Kohn于1976年首先提出的.对于DNA单链或双链断裂、DNA-DNA交联、DNA-蛋白质交联和碱标记点等初级DNA损伤的检测,碱洗提优于现有的任何一种检测方法,并被推荐用于甄别环境中具遗传毒性的物质.Bihari、Vukmirovic和Batel等在90年代先后对此方法进行了改进,不仅成功地用于检测海洋无脊椎动物血淋巴的DNA损伤,还可检测出DNA-DNA交联和DNA-蛋白质交联.3.1dna的提取碱洗提过滤系统包括一个与过滤支持器相连的20mL注射器,支持器上放一孔径为0.22μm的滤膜,支持器通过聚乙烯管连在一个32道Gilson微脉冲Ⅱ型蠕动泵上.将一定量的血淋巴加在滤膜上,先用pH为10的碱性溶液裂解细胞,再用碱性更强的溶液(pH=12.3)以一定的流速避光洗提单链DNA并收集洗提液.过滤后收集留在滤膜上未被洗提的DNA.3.2荧光强度的测定每2mL洗提液加0.1mL1.3mol的KH2PO4,加入Hoechst33258荧光染料储备液,使体系中染料的最终浓度为2.5×10-6mol.在激发波长360nm读出450nm处的荧光强度.以小牛胸腺DNA为标准,DNA含量在10ng到1μg之间,荧光强度呈线性.3.3ssf的计算结果可以滤膜上DNA所占百分数或链分离因子SSF(strandscissionfactor)来表示.SSF是一个相对值,可按下式计算.SSF=lg％DNASample％DNAControlSSF=lg％DΝASample％DΝAControl%DNAsample=样品洗提后滤膜上的DNA;%DNAcontrol=对照组洗提后滤膜上的DNA.SSF=0说明没有DNA链断裂,SSF<0说明与对照组相比,处理样品中有DNA断裂.3.4博来霉素-fe2+物理剂检测生物尽管碱洗提可以很好地检测蟹和贻贝血淋巴中DNA单双链断裂,但对于交联所导致的DNA损伤,以往的碱洗提必须通过X射线照射样品才能检测.但照射整个生物尤其海洋生物几乎是不可能的.为了找到一种简单、非放射性并能够用于检测海洋生物DNA损伤的方法,Batel和Vukmirovic试验了采用博来霉素-Fe2+复合物来检测DNA十字交联的碱洗提方法.检测过程包括博来霉素-Fe2+的活性复合物的准备以及它在碱洗提初始步骤——洗提中的应用.直接在过滤中用博来霉素-Fe2+的复合物处理血友病细胞的自由DNA和贻贝血淋巴都得到了很好的浓度-链分裂相关系数(分别为r=0.94和r=0.98).4碱性叶片微凝胶电泳技术1978年Rydberg和Johanson等最先对单细胞DNA损伤定量,但因操作步骤烦琐未得到广泛应用.此后同一实验室又发展了中性微胶电泳技术,在中性条件下水解和电泳只能检测到DNA双链断裂.Singh等于1988改进并建立的碱性单细胞微凝胶电泳技术(Singlecellmicrogelelectrophoresis,简称SCGE或SCG),用溴化乙锭染色能显示DNA单链断裂和遇碱不稳定位点.SCG技术的原理是:首先在细胞裂解液的作用下破坏细胞膜、核膜和其它膜结构,这样细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶并扩散到裂解液中,而核DNA因分子量高且具有严密的超螺旋结构而留在原位.然后用碱处理并在碱性条件下电泳,DNA解螺旋且碱变性为单链,若细胞DNA受损有遇碱不稳定位点和单链断裂则会出现分子量较小的DNA片段.在电场中,小DNA片段就会离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动,形似彗星,故又称SCG为彗星实验(Cometassay).4.1琼脂糖固化lma共分三层凝胶,首先在45℃将100μl正常熔点琼脂糖(NMA)浇注到磨砂或磨粗的载玻片上,迅速盖上盖玻片,置4℃10min使琼脂糖固化,此为第一层.然后在37℃将约1000个受检细胞与75μL低熔点琼脂糖(LMA)混合.轻轻移开盖玻片,迅速将细胞悬液滴到第一层琼脂糖上,盖上盖玻片使其均匀铺开,置4℃10min使琼脂糖固化为第二层.室温下移开盖玻片,将预热为37℃的75μl低熔点琼脂糖作为第三层加上,置4℃10min使琼脂糖固化.4.2上、pla和tri能力移去盖玻片,将载玻片水平浸入新配置的4℃细胞裂解液(2.5mol/LNaCl,100mmol/LEDTA,10mmol/LTris-HC1pH=10,1%肌氨酸钠,用前加1%TritonX-100,10%二甲亚砜)中至少2h.4.3dna电泳取出载玻片,晾干,并列置于水平电泳槽的阳极端.电泳槽中盛有新配置的碱性电泳缓冲液(1mmol/LNa2EDTA,300mmol/LNaOH),约覆过载玻片胶面0.25cm,放置40min以便DNA在电泳前解螺旋.4.425v电压电压，300ma，40min4.5trs-hc1的染色电泳后,将载片置染缸,用pH=7.5,0.4mol/LTris-HC1缓冲液浸洗三次,每次15min.呈中性后,改用无水乙醇浸埋1h,晾干或室温下过夜.每片加50μL30μg/mL溴化乙锭(EB)水溶液染色20min.4.6dna直径和移出的dnaEB染色后的样本应尽快在荧光显微镜下观察测定,或拍摄X400黑白显微照片后测量.每个样本至少随机测定25个细胞,测核DNA直径和移出的DNA(即彗星尾)长度、彗星面积.最好借助自动数字图象处理系统进行分析,它能提供描述彗星整体和头尾各部特征的全范围密度及几何参数.Gedik和Ewen等认为彗星尾长与DNA单链断裂数目相关.但损伤严重时,尾中荧光强度更能反应断裂频数.定性分析时最好用彗星长度,若要得到剂量-反应关系,不宜采用彗星长度而应用彗星面积或尾部荧光强度为参数.4.7scge用于环境致畸物所导致的dna损伤自从Singh等于1988对该方法进行了改进后,SCGE就以其简便、低耗和可对单个细胞进行分析等优点迅速在生物DNA损伤研究领域得到广泛应用.近来已有人将此方法应用于鱼类,并取得了不同程度的效果.Pandrangi等以美洲洄鱼(Ameiurusnebulosus)和鲤鱼(Cyprinuscarpio)为实验对象,发现SCGE可用于检测环境致畸物所导致的DNA损伤.Belpaeme等用SCGE测定多氯联苯对棕鳟(Salmotrutta)的影响以及Nacci等研究鲽(Pleuronectsamericanus)的时候,虽然都遇到了来源于种内和种间的反应差异,但都认为该方法可用于检测环境样品的DNA损伤和修复.Wilson等于1998年对彗星实验作为一种检测海洋无脊椎动物-紫贻贝细胞DNA损伤的方法进行了详尽的评价.他们仔细调查了离体鳃细胞单链断裂的本底,动物的个体大小和年龄、距采样时间的长短、摄食节律、体内体外染毒条件和抗氧化剂的作用是如何影响单链断裂的.结论认为该方法用于检测目标物质在海洋环境的排放是很有潜力的.5两种遗传方法5.1brd染色工艺早在1957年,Taylar就用放射自显影技术在蚕豆中观察到姐妹染色单体交换的现象.1974年后,随着方法的不断改进,已广泛用于各种致突变剂的检测.常用的5′-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法,其原理和方法是在DNA复制过程中,在培养基中加入BrdU代替胸腺嘧啶核苷掺入到新合成的DNA链中.于是两条姐妹染色单体各有一条在化学组成上含有BrdU.经过第二次复制后,两条染色体中就有一条单体的DNA双链都是由BrdU代替胸腺嘧啶所组成的.常规方法制片后用吉姆萨(Giemsa)染色,根据着色深浅的不同可判断姐妹染色单体发生交换的频率.Pasantes等于1996年探讨了影响地中海贻贝姐妹染色单体交换频率的多种因素,发现SCE频率与BrdU有明显剂量-反应关系且个体间的差异也较显著.这些因素在实际应用中都应加以重视.5.2用于海洋无脏器的微核试验Howell在1891年最先在红细胞中发现微核,它是染色体断裂和纺锤体受损伤的产物,是出现在细胞核附近的含DNA小体.微核测定法操作简便并可指示细胞遗传损伤,自70年代初期国内外在该领域的研究一直十分活跃.Brunetti和Majone等在1988年首次将该实验用于海洋无脊椎动物:调查了不同污染海区紫贻贝鳃细胞微核发生率并指出应注意年龄和季节等生理元素及水温缺氧等理化因子的影响.之后,有大量研究都检测了双壳类细胞内的微核,如Paola等则在对暴露于B[a]P的贻贝鳃和血淋巴细胞的微核研究中详细探讨了操作细节以及适用的细胞处理方法.研究表明,微核频率在巨鳃细胞和无颗粒白细胞中都明显上升.但颗粒白细胞在不同个体所占比例差异较大且除高浓度B[a]P外,未见明显细胞遗传学损伤.无论采用何种组织都要获取足够的细胞,然后在常规方法制片、染色、油镜(1000X)下观察,记录其中具有微核的细胞数,以千分率表示微核细胞率.6scg检测生物dna损伤的实验价值和方法学研究表1归纳了本文介绍的几种DNA损伤检测方法的相关参数.1)DNA加合物的形成是化学致畸、致癌的引发步骤,非常关键.32P后标记法检测DNA加合物,灵敏度高(可达1加合物/109~1010正常核酸)、不用事先制备标样且能用空白对照定量计算加合物含量,还可以根据加合物指纹图谱鉴定由不同化合物形成的加合物.该方法的不足之处是操作过程相对较烦且用到高放射活性的32P,需要一定的保护措施.目前已有人用生物荧光素代替32P进行标记.2)碱洗提法与碱解旋法相比,不仅可以检测到DNA单链或双链断裂还可以区别DNA-DNA交联、DNA-蛋白质交联和对碱不稳定位点等几种DNA损伤.1994年,Vukmirovic等的研究表明,要监测