α-半乳糖苷酶检测方法

a-半乳糖苷酶酶活力的测定方法1・a-半乳糖苷酶酶活力单位定义在pH5.5并37°C条件下，每分钟内底物降解释放l“mol对硝基酚所需要的酶量为一个酶活单位U。2・测定原理a-半乳糖苷酶能将对硝基酚-a-D-吡喃半乳糖降解成对硝基酚。通过400nm比色测定释放的对硝基酚的量，可以计算反应液中a-半乳糖苷酶的活力。3・试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均符合GB/T6682中规定的三级水。0.05mol/L醋酸钠缓冲液：A液：称取无水醋酸钠4.2g定容至lOOOmL；B液：冰醋酸3.0mL定容至1000mL。用B液调节A液至pH5.5。0.2mol/L碳酸钠溶液：准确称取21.198g无水碳酸钠，定容至1000mL。对硝基酚标准溶:(10mmol/L)称取0.1391g对硝基苯酚，精确到0.001g,用碳酸钠溶液定容至100mL,低温保存。依次移取对硝基苯酚标准贮备液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、7mL、9mL,用碳酸钠溶液定容至100mL,配成浓度为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、0.9mmol/L的对硝基苯酚标准工作液。10mmol/L对硝基酚-a-D-吡喃半乳糖溶液：称取3.031g对硝基酚-a-D-吡喃半乳糖，用醋酸钠缓冲液定容至1000mL，置棕色试剂瓶于4C以下保存。4・仪器与设备4.1实验室用样品粉碎机或碾体。4.2分样筛：孔径为0.25mm(60目)。4.3分析天平：感量为O.OOlg。pH计：精确至0.01。磁力搅拌器：附加热功能。电磁震荡器4.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45Amo4.8离心机：2000g以上。4.9恒温水浴锅：温度控制范围在30-60之间，精度为0.1°C。4.l0WhatmanNo.l滤纸。4.11分光光度计：能检测350-800nm的吸光度范围。标准曲线的绘制吸取1mL对对硝基酚标准溶液(3.3)于试管中，加入1mL醋酸钠缓冲液(3.1)；对照的空白试管中加入2mL醋酸钠缓冲液(3.1)；在所有的试管中加入8mL碳酸钠溶液(3.2)，振荡，在400nm处测定吸光度OD值。以对硝基酚浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛(孔径为0.25mm)。称取固体样品1g左右，用80mL醋酸钠缓冲液(3.1)浸泡，磁力搅拌30分钟，用醋酸钠缓冲液(3.1)定容至100mL，用WhatmanNo.1滤纸过滤。液体试样可以直接用醋酸钠缓冲液(3.1)进行稀释和定容。当酶液的酶活在20U/mL以内，测试结果较准确。测定步骤将上速稀释酶液(6)和底物对硝基酚-a-D-吡喃半乳糖溶液(3.4)于37C下振荡10分钟预热。然后再吸取各溶液0.1mL，充分混合，于37C恒温振荡10分钟，加入0.8mL碳酸钠溶液(3.2)，振荡混匀，终止酶反应，以蒸馏水调零，在400nm处测定吸光度OD值。酶液空白用经过预热的酶液各0.1mL，然后加入0.8mL碳酸钠溶液(3.2),振荡混匀，再各加入0.1mL预热的底物对硝基酚-a-D-吡喃半乳糖溶液(3.4)于37C振荡10分钟，在400nm处测定吸光度OD值。8.试样酶活力的计算([Ax-Ao]*K+Co)*DfX=Ax——样品酶液的吸光度OD值；Ao——对应酶液的空白吸光度OD值；K——对硝基酚的标准曲线的斜率；Co——对硝基酚的标准曲的截距；Df——稀释倍数；M——称取酶制剂的质量g;T 反应时间min;X---试样a-半乳糖苷酶的活力U/g；9.重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。甘露聚糖酶活力的测定方法1.甘露聚糖酶活力单位定义在37°C、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中降解释放lymol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均符合GB/T6682中规定的三级水。甘露糖溶液，c(C6H12O6)为10.0mg/mL：称取无水D-甘露糖l.OOOg，加水溶解，定容至100mL。乙酸溶液，c(CH£OOH)为O.lmol/L：吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。乙酸钠溶液，c(CHfOONa)为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100mL。3.4氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L：称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。乙酸一乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH--CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5。甘露聚糖溶液，0.6%(w/v)称取甘露聚糖(SigmaG0753)0.60g，加入80mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(3.5)。磁力搅拌同时缓慢加热至甘露聚糖完全溶解(注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲溶液，但是溶液的总体积不能超过100mL)。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100mL。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀O4C避光保存，有效期为3天。3.7DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s,水浴至45°C。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，直到溶液澄清透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度最好不要超过48C。）再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45C水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。仪器与设备实验室用样品粉碎机或碾体。分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3分析天平：感量为O.OOlg。4.4pH计：精确至0.01。磁力搅拌器：附加热功能。电磁震荡器4.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45Amo4.8离心机：2000g以上。4.9恒温水浴锅：温度控制范围在30-60C之间。精度为0.1Co4.10秒表：每小时误差不超过5s。4.11分光光度计：能检测350-800nm的吸光度范围。4.12移液器：精度为1L标准曲线的绘制吸取缓冲液（3.5）4.0mL，加入DNS试剂（3.7）5.0mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。分别吸取甘露糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00mL，分别用缓冲液（3.5）定容至100mL，配制成浓度为0.10-0.70mg/mLD-甘露糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试

管中，再分别加入2mL缓冲液（3.5）和5mLDNS试剂（3.7）。电磁震荡3s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL。以标准空白样对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至O.OOlg。加入50mL乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5））磁力搅拌30min,再用缓冲液（3.5）定容至100mL,在4°C条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50mL,2000g离心3min。吸取5.00mL上清夜，再用缓冲液（3.5）做二次稀释（稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶的活力最好能控制在0.04-0.08U/mL之间）。液体试样可以直接用乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）进行稀释和定容（稀释后酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04-0.08U/mL之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5，需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5，然后再用缓冲溶液（3.5）做适当定容。测定步骤吸取lO.OmL甘露聚糖溶液（3.6）,37C平衡lOmin。吸取10.0mL经过适当稀释的酶液，37C平衡10min。吸取2.0mL经过适当稀释的酶液（已经过37C平衡），加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂（3.7）,震荡5s。然后加入2.0mL甘露聚糖溶液（3.6），37C保温30min，沸水浴加热7min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，震荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。B吸取2.0mL经过适当稀释的酶液（已经过37C平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0mL甘露聚糖溶液（3.6）（已经过37C平衡），震荡5s，37C精确保温30min。加入5mLDNS试剂（3.7）,震荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热7min,用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，震荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度Ae。E8试样酶活力的计算XD=(AeXD=(Ae-AB)xK+Co〕EB OMxWxtxlOOO式（1）中：XD---试样稀释液的甘露聚糖酶活力，U/mL；AE---酶反应液的吸光度；EAB---酶空白样的吸光度；K---标准曲线的斜率；CO---标准曲线的截距；M---甘露糖的分子量（180.2）；W--样品