中药制剂的杂质检查技术-黄曲霉毒素检查

作者：八音魔琴中药制剂的杂质检查技术●中药制剂检查●中药制剂鉴别●中药制剂含量测定高效液相色谱法检查黄曲霉毒素贰壹目录基础知识必备知识精诚制药

本草济民叁拓展知识黄曲霉毒素：主要由黄曲霉（aspergillusflavus）、寄生曲霉（aparasiticus）产生的次生代谢产物，它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。

《中国药典》2015年版柏子仁等14味易受黄曲霉毒素感染药材及饮片增加了“黄曲霉毒素”检査项目和限度标准。

方法：高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法两种一、基础知识二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。二、必备知识色谱条件与系统适用性试验填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：甲醇-乙腈-水（40：18：42）检测方法：柱后衍生法检测①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；②光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm（或365nm），发射波长λex=450nm。分离度：两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。高效液相色谱法检查黄曲霉毒素二、必备知识色谱条件与系统适用性试验填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：甲醇-乙腈-水（40：18：42）检测方法：柱后衍生法检测①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；②光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm（或365nm），发射波长λex=450nm。分离度：两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。高效液相色谱法检查黄曲霉毒素二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别1.0µg/ml、0.3µg/ml、1.0/µg/ml、0.3µg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加人氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45µm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5µl、l0µl、15µ1、20µ1、25µ1，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20~25µ1，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素注意事项本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。黄曲霉毒素的危害：2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，黄曲霉毒素在一类致癌物清单中。黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质，黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。三、拓展知识高效液相色谱-串联质谱法检查黄曲霉毒素贰壹目录基础知识必备知识精诚制药

本草济民叁拓展知识黄曲霉毒素：主要由黄曲霉（aspergillusflavus）、寄生曲霉（aparasiticus）产生的次生代谢产物，它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。

《中国药典》2015年版柏子仁等14味易受黄曲霉毒素感染药材及饮片增加了“黄曲霉毒素”检査项目和限度标准。

方法：高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法两种一、基础知识二、必备知识高效液相色谱-串联质谱法检查黄曲霉毒素本法系用高效液相色谱-串联质谱法测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素色谱条件与系统适用性试验填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：流动相A：l0mmol/L醋酸铵溶液流动相B：甲醇柱温：25℃流速：0.3ml/min按下表进行梯度洗脱：时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）0〜4.565→1535→854.5〜615→085→1006〜6.50→65100→356.5〜106535二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素色谱条件与系统适用性试验检测器：三重四极杆串联质谱仪、电喷雾离子源（ESI）采集模式：正离子模式各化合物监测离子对和碰撞电压（CE）见下表：编号中文名英文名母离子子离子CE(V)1黄曲霉毒素G2AflatoxinG2313.1313.133331.1245.1402黄曲霉毒素G1AflatoxinG1329.1243.135329.1311.1303黄曲霉毒素B2AflatoxinB2315.1259.135315.1287.1404黄曲霉毒素B1AflatoxinB1313.1241.050313.1285.140二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素系列混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的标示浓度分别1.0µg/ml、3µg/ml、1.0µg/ml、0.3µg/ml）适量，用70%甲醇稀释成含黄曲霉毒素B2、G2浓度为0.04~3ng/ml，含黄曲霉毒素B1、G1浓度为0.12~l0ng/ml的系列对照品溶液，即得（必要时可根据样品实际情况，制备系列基质对照品溶液）二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加人氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45µm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素测定法精密吸取上述系列对照品溶液各5µl，注人高效液相色谱-质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液5µl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的浓度，计算，即得。二、必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素注意事项本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理当第一法测定结果超出限度时，采用本法进行确认现行的2015版《中国药典》规定黄曲霉毒素检查的19种中药材，品种有：根及根茎类：远志；果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟榔、酸枣仁、薏苡仁；动物类：水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、僵蚕。要求黄曲霉毒素B1不得过5μg/kg；黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2总量不得过10μg/kg。

《中国药典》对黄曲霉毒素检测要求，既突出了中药整体质量控制的特点，又增加和完善了安全性控制方面的要求。三、拓展知识中药制剂的杂质检查技术——高效液相色谱法检查黄曲霉毒素25目录

基础知识1必备知识2拓展知识326基础知识

黄曲霉毒素：主要由黄曲霉（aspergillusflavus）、寄生曲霉（aparasiticus）产生的次生代谢产物，它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。《中国药典》2015年版柏子仁等14味易受黄曲霉毒素感染药材及饮片增加了“黄曲霉毒素”检査项目和限度标准。

方法：高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法两种本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素色谱条件与系统适用性试验填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：甲醇-乙腈-水（40：18：42）检测方法：柱后衍生法检测①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；②光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm（或365nm），发射波长λex=450nm。分离度：两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素混合对照品溶液的制备

精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别1.0µg/ml、0.3µg/ml、1.0/µg/ml、0.3µg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。必备知识高效液相色谱法检查黄曲霉毒素供试品溶液的制备

取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加人氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45µm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱