小鼠脚趾DNA提取以及基因型鉴定

小鼠脚趾DNA提取以及Macf1fl/flC57BL/6-Prrx1-Cre小鼠基因型鉴定张茹2016年3月15日一.小鼠脚趾DNA提取【原理】提取过程真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的过程是将动物组织在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的消化液中消化分解蛋白质，再用酚抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA析出来。裂解液各成分作用在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质，从而使细胞裂解，并使组织蛋白与DNA分离。EDTA可以整合镁离子，这样将会抑制细胞中Dnase的活性；因为该酶必须在有镁离子存在下才会起作用。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。并且可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。Tris苯酚作用酚是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚作为有机溶剂比重更大，保留在最下层。【实验材料】耗材1.5ml离心管，水浴锅，高速冷冻离心机，1ml移液枪，200ul移液枪，通风橱，1ml移液枪枪头，200ul移液枪枪头。试剂Tris-HCl,EDTA，NaCl,SDS，灭菌水，Tris苯酚，无水乙醇，75%乙醇，1倍TE缓冲液【实验步骤】1.SNET裂解液（50ml）：100mMTris-HCl（10ml,PH8.0）,200mMEDTA（1.25mlPH8.0），1MNaCl（20ml）,10%SDS（5ml）,水（13.75ml）。（裂解液在常温下结晶，使用之前在55°C水浴锅中预热）蛋白酶K（PK）:储存浓度：10mg/m1；终浓度：100ug/ml2、操作步骤:1）小鼠标记编号，并收集小鼠脚趾样品于1.5mlEP管中（提前高压灭菌）。2）提前准备55C水浴锅，并把4C离心机打开（300rmp离心降温至4C）。3）往装有小鼠脚趾组织的EP管里加入400ulSnet裂解液，4ul蛋白酶K（实验

经验，充分消化可加6-7ul），其浓度是10mg/m1，即终浓度为100ug/ml；4）置于55C水浴锅中裂解1h（实验经验，充分裂解需2.5-3.5h）；5）待组织裂解完后，在通风厨中加入400ulTris饱和酚（除去蛋白质杂质），剧烈震荡20s（实验经验，剧烈震荡100多次），至呈乳浊液；6）12,000g，4C,离心10min（所有管子方向一致）；7）吸取上清330-390ul于新的EP管中（缓慢吸取，勿吸到蛋白层），加二倍体积的无水乙醇（即660-780ul），轻摇出现白色絮状沉淀（轻摇100多次，充分混匀）；8）同第五步离心后，用1ml枪头一次吸取上清，留剩余刚好淹没沉淀；9）加1ml75%乙醇，12,000g,4C离心5min；10）用1ml枪头一次吸取上清，留剩余刚好淹没沉淀；11）12,000g,4C离心3min；12）用200ul枪吸干上清（在沉淀对面吸取），通风橱中晾干；13）根据沉淀量多少加20~50ul无菌水溶解DNA沉淀，吸吹10~15次，混匀。二.MacHfl/nC57BL/6-Prrx1-Cre小鼠的基因型鉴定1•鉴定原理鉴定Macflfl/flC57BL/6-Prrxl-Cre小鼠的基因型，要基于本小鼠构建的原理。本小鼠模型构建基于Cre/LoxP系统的条件性基因敲除技术，即在组织或细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠的作用下，实现在特定细胞及特定发育阶段敲除目的基因研究其功能。本研究在骨髓间充质干细胞的标记分子Prrxl基因中插入Cre基因，即构建为Prrxl-Cre小鼠，特异性的表达Cre酶。LoxP位点标记MACF1基因片段，即构建为MACFl-Flox小鼠。这两种小鼠交配，使得Cre基因被可诱导的Prrxl启动子控制，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的MACFl基因切除，从而繁殖得到骨髓间充质干细胞中特异性敲除MACFl基因的小鼠。通过设计引物，pcr扩增片段长度，判断子代小鼠是否插入LoxP位点，以及是否插入Cre位点，从而鉴定子代小鼠基因型。Cre重组酶敲除LoxP修饰位点的过程2・鉴定方案及鉴定图2.1Macfl打靶的基因型鉴定2・1・1引物设计位点引物设计在LoxP插入的基因片段上，LoxP位点长34bp，野生型片段片段长700bp，含LoxP位点的片段长750bp。WrldtypeaileiefWT}

2.1.2PCR引物序列信息PrimerSequenceProductsizeMACF1-AP179AAAGAAACGGAAATACTGGCC-700bp55MACF1AP180GCAGCTTAATTCTGCCAAATTC542.1.3PCR反应程序951C5min953fls(x:35cycle621C30sec72V35s(x;lOrnin41：10mir2.1.4鼠尾DNA的基因型鉴定结果MACF1-AP17fl/1fiOR1SZC2SZC1-122-291-51-2111-231-11-92-122-152-172-102-232-2&2-322-352-92-22+WT角O若只能扩增得到700bp条带，说明小鼠是野生型；若只能得到750bp条带，说明是纯合子小鼠；若能得到700bp和750bp两个条带，说明是杂合子小鼠。2.2Prrx1-iCre的基因型鉴定：2.2.1引物设计位点鉴定是否含Cre基因。需要两种引物，一种用来扩增野生型的短片段，一种用来扩增突变型的长片段。WT-F/R设计在基因组上，用于扩增野生型产物(267bp)；Mut-R引物设计在Cre上,WT-F/Mut-R引物用来扩增突变型产物(322bp)。

Cre基因的鉴定2.2.2PCR引物信息PrimersequenceTmProductSizePrrx1-iCre-WT-FAGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC60WT:267bpPrrxl-iCrc-WT-RAGTCCCGGTGACTCCAGCAG62Prrx1-iCre-WT-FAGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC62Mut322bpiCre-Mut-R2GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG602.2.3PCR反应程序95匚Smiri95TCSniin95匸3Qsec35cycle95©Sflsec35cycle62V30sec62TC30scc72T?20scc72r25soc72r?lOmin72TClOmin4ClOmin4tlOmin2.2.4鼠尾DNA的基因型鉴定结果Prn<1-iCre-WT-F/iCre-Mul-R21SZC2SZC1-122-291-51-211-231-11-92-122-152-172-102-232-2^2-322-352-92-2