依那普利联合灯盏花素对大鼠糖尿病肾脏保护作用及机制研究

依那普利联合灯盏花素对大鼠糖尿病肾脏保护作用及机制研究

糖尿病性肾炎（dn）是糖尿病最常见的慢性并发症之一。二羟甘油-蛋白激酶c（pec）的激活机制是过度激活的。实验研究证实应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、抗氧化剂、PKC抑制剂可以延缓DN进展,其机制部分与抑制PKC活性有关。灯盏花素(breviscapine)是从菊科飞蓬属植物短亭飞蓬全草灯盏细辛中提取的一类黄酮类成分,其药理作用有较强抗氧化、抑制PKC活性的作用。我们于2003年3月至2004年9月观察了依那普利(一种ACEI)联合灯盏花素对实验性DN是否具有协同保护作用,报道如下。材料和方法一、材料表面1.安徽医科大学动物中心昆明种雄性Sprague-Dawlay大鼠,体重180～200g,安徽医科大学动物中心提供。在恒温(22℃)、相对湿度65%～70%、光照周期12h的环境中适应饲养1周后实验。2.羧甲基纤维素钠配标灯盏花素:含黄酮4.5mg/20mg,云南玉溪药业有限公司产品批号:临用前用5g/L羧甲基纤维素钠配至所需浓度。依那普利:默沙东公司产品批号:临用前用5g/L羧甲基纤维素钠配至所需浓度。3.试剂和试剂盒链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购自美国Sigma公司,临用前溶解在0.01mol/L枸橼酸缓冲液中,pH4.5;尿白蛋白测定试剂盒购自法国SPI公司;丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;PKC活性测定试剂盒购自美国Calbiochem公司;小鼠抗大鼠PKC单克隆抗体,羊抗小鼠IgG、HRP标记的羊抗小鼠IgG及链酶亲和素-生物素复合物(SABC)购自武汉博士德公司产品;硝酸纤维膜购自美国Amersham公司;ECL发光试剂购自美国PIERCE公司。二、方法1.糖尿病大鼠血糖等指标检测腹腔1次性注射STZ60mg/kg,48～72h后尾静脉采血,血糖仪测定全血血糖,血糖16.7mmol/L以上确定为糖尿病大鼠,对照组仅注射等量枸橼酸缓冲液。2.分组及给药方案所有大鼠均行右侧肾切除术,2周后设对照组、糖尿病组、依那普利给药组、灯盏花素给药组及依那普利与灯盏花素联合给药组。大鼠按体重分层随机分组,每组10只。用药方案:依那普利10mg.kg-1.d-1;灯盏花素20mg.kg-1.d-1灌胃给药;依那普利与灯盏花素联合给药组两者同样剂量联合给药;对照组与糖尿病组组给予等量溶媒。所有大鼠在整个实验期间均喂标准饮食,自由饮水,不应用胰岛素。整个实验观察8周。3.肾组织pas染色大鼠处死前2d进代谢笼,收集24h尿液测尿白蛋白、MDA含量。大鼠空腹16h后,在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右侧颈总动脉插管收集血标本测血糖水平;肾脏在经灌洗后游离,取8mm3大小肾组织置于10%中性甲醛溶液中固定,常规脱水、包埋,制成厚度为3μm切片行PAS染色,同时制4μm多聚赖氨酸处理切片免疫组化观察。剩余肾组织置于液氮中,冻透后转入-70℃冰箱中待测肾组织MDA含量、PKC活性及蛋白表达。4.尿白蛋白泄漏率采用特异性酶联免疫方法,测定24h尿白蛋白排泄率(albuminexcretionrate,AER),为尿白蛋白含量与24h尿量的乘积。5.肾组织结构指标PAS染色切片高倍镜下随机选择30个肾小球与30个肾小管间质(无肾小球与血管),应用病理图像分析系统软件(北京航空航天大学开发)测定肾小球平均面积(AG)、肾小球平均容量(VG)、肾小球系膜区面积(AM)及肾小管间质面积。所测肾小管-间质面积按以下标准评分:0:正常;1:间质炎症与纤维化、肾小管萎缩与扩张伴管型形成<25%所测区域;2:损伤面积在25%～50%所测区域;3:损伤面积>50%所测区域。肾小管-间质损伤指数(indicesfortubulointerstitialinjury,TII)为以上各积分平均值。6.测定肾脏组织和肾脏mda的含量MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法。7.pkc酶活性测定肾组织细胞膜和细胞浆分离采用超速离心法,蛋白定量采用考马斯亮蓝法,PKC活性采用放射活性测定法。胞浆PKC(PKCc)及胞膜PKC(PKCm)活性均以所测的实际活性与对照组所得的活性之差表示,细胞PKC总活性(PKCt)为胞浆及胞膜PKC活性之和。8.小鼠免疫印迹化学发光试验lleupepmin取100mg肾组织置入悬浮液(0.1mol/LNaCl,100mmol/LTrisHCl,10mmol/L乙二胺四乙酸,100μg/ml苯甲基磺酰氟,2(g/mlleupeptin)0.25ml匀浆,4℃12000r/min离心2min,取上清测蛋白浓度。取30μg蛋白煮沸5min后,经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移至硝酸纤维膜上,在5%脱脂奶粉-PBST溶液室温下封闭1h,洗膜后加入小鼠抗大鼠PKC抗体(1∶1000)4℃过夜,再用辣根过氧化物酶标记的二抗杂交和辣根过氧化酶标记的链霉卵白素液杂交,37℃,1h。洗膜后在暗室中加免疫印迹化学发光试剂,X线胶片曝光1～2min后显影、定影。杂交信号在图像分析系统中进行吸光度扫描。对照组假定为100%,其余组是与其相比而得到的相对量。9.小鼠肝肾免疫组化采用链酶亲和素-生物素复合物(SABC)方法:切片常规脱蜡,用3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化酶,应用微波炉暴露抗原后封闭内源性生物素。加兔抗大鼠TGFβ1多单克隆抗体(1∶100),4℃过夜,再加生物素化羊抗兔IgG(1∶200),室温30min,滴加SABC,室温30min,滴加DAB显色液,镜下控制着色时间。实验采用删除第一抗体作阴性对照。阳性物质呈棕色颗粒状,肾小球TGFβ1免疫组化结果判断按下列方法进行半定量评分:0分:微弱或无染色;1分:染色面积<25%;2分:染色面积25%～50%;3分:染色面积50%～5%;4分:染色面积>75%。肾小管-间质TGFβ1免疫组化结果判断应用图像分析系统,计算其阳性面积占肾小管-间质面积百分比(%),取均值进行比较。三、分布资料及受损因子正态分布资料以ˉx±s表示,尿白蛋白排泄率为非正态分布资料,用几何均数表示,耐受因子表示。应用SPSS10.0软件包进行统计分析,参数资料采用One-WayANOVA检验,非参数资料采用秩和检验。结果一、一般指标的变化见表1。二、依那普利与灯美国酒交通共同给药组ag、vg、am依那普利组与灯盏花素组及联合给药组AG、VG、AM明显低于糖尿病组(P<0.05或P<0.01);依那普利与灯盏花素联合给药组AG、VG、AM明显低于依那普利或灯盏花素单给药组(P<0.05);灯盏花素与依那普利联合给药组TII明显低于糖尿病组(表2)。三、给药组与模型组p>0.05和p/0.1见表3。糖尿病组肾组织和尿MDA含量明显高于对照组(P<0.01),各给药组均明显低于模型组(P<0.05或P<0.01);依那普利与灯盏花素联合给药组肾组织MDA含量明显低于依那普利单给药组,尿MDA含量明显低于依那普利或灯盏花素单给药组(P<0.05)。四、对比2组患者的糖尿病方案糖尿病组肾组织PKCt活性、PKCc活性、PKCm活性及PKCm/PKCc明显高于对照组(P<0.05或P<0.01),各给药组肾组织明显低于糖尿病组(P<0.05);依那普利+灯盏花素联合给药组肾组织PKCm活性及PKCm/PKCc明显低于依那普利或灯盏花素单给药组(P<0.05)(表4)。TGFβ1在对照组肾小球与肾小管-间质有少量表达,糖尿病组表达明显高于对照组(P<0.01),各给药组均明显低于糖尿病组(P<0.05或P<0.01);依那普利与灯盏花素联合给药组TGFβ1表达明显低于依那普利或灯盏花素单给药组(P<0.05)(表4,图2～6)。五、肾组织pkc蛋白表达水平Western杂交条带吸光度扫描显示糖尿病组肾组织PKC蛋白表达明显高于对照组(P<0.01),依那普利+灯盏花素联合给药组明显低于依那普利单给药组(P<0.05)(图1)。dn肾功能损害的保护作用PKC激活是细胞内诸多信号转导系统相互影响的中心环节。有研究表明,PKC抑制剂灯盏花素能降低STZ诱导的糖尿病模型蛋白尿,改善肾小球结构异常,但灯盏花素对尿蛋白、肾小球容量的增加仅起部分改善作用,且对肾小管-间质损害无明显改善作用,提示灯盏花素对DN仅起部分保护作用。本研究显示,依那普利与灯盏花素联合给药对肾小球容量与AER增加的抑制作用优于各自单独给药,几乎达对照组水平。更重要的是,依那普利与灯盏花素单独给药对糖尿病肾小管-间质损伤均无明显改善作用,依那普利与灯盏花素联合给药对糖尿病肾小管-间质损伤有显著改善作用。有研究证实,人类DN肾小管-间质纤维化程度与系膜扩展、肾小球滤过率下降率及蛋白尿程度呈正相关,DN模型特征性病理改变——细胞外基质集聚不仅发生在肾小球,而且发生在肾小管-间质,肾小管-间质损伤程度是决定DN预后的关键指标之一。因而,依那普利与灯盏花素联合给药对DN有更强肾脏保护作用。氧化应激所产生的氧反应产物(reactiveoxygenspecies,ROS)与PKC激活既能各自通过细胞内信号转导途径诱导损伤介质增加,致肾脏损害,又能相互激发、活化使肾脏损害加重。葡萄糖、血管紧张素Ⅱ可激活PKC、增加ROS产生。本研究表明,依那普利与灯盏花素各自单独给药均能部分降低糖尿病肾组织与尿中MDA含量及肾组织中PKC的含量与活性,依那普利与灯盏花素联合给药几乎完全抑制肾组织与尿中MDA含量及肾组织中PKC的含量与活性的增加,提示依那普利与灯盏花素对氧化应激与PKC激活有协同抑制作用。TGFβ1是DN肾小球与肾小管-间质损伤发病机制中最为关键前硬化生长因子,近年研究表明ROS与PKC激活可通过p38有丝分裂原活化蛋白激酶、Janus激酶/信号转导与转录激活剂途径,诱导核转录因子(B和激活蛋白-1基因转录,上调TGFβ1表达,通过其下游反应介质CTGF介导促进肾小球与肾小管-间质细胞肥大、细胞外基质合成增加,促进DN发展