依那普利对肾间质纤维化大鼠肾组织gf-

依那普利对肾间质纤维化大鼠肾组织gf-

肾间质纤维是所有慢性肾疾病进展的共同通道，是肾衰竭的主要病理基础。转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)是促进肾间质纤维化形成与发展的关键因子,TGF-β主要通过Smads信号通路诱导其下游因子表达而产生致纤维化效应,TGF-β/Smads信号通路在肾间质纤维化的发生发展过程中起重要作用。血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-convertingenzymeinhibitor,ACEI)在多种实验动物模型及人类肾脏疾病的治疗中均显示出良好的肾脏保护作用。本实验通过建立单侧输尿管梗阻(unilateralurethralobstruction,UUO)诱导的大鼠肾间质纤维化模型,观察ACEI类药物依那普利对肾间质纤维化大鼠肾组织中TGF-β1,p-Smad2/3及Smad7表达的影响,探讨ACEI抗肾间质纤维化的作用机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试剂和试剂盒依那普利片购自苏州扬子江制药公司(商品名依苏);羊抗鼠ColⅠ多克隆抗体、兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体、兔抗鼠p-Smad2/3多克隆抗体及羊抗鼠Smad7多克隆抗体均购自美国SantaCruz公司;二抗试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新生物试剂公司;TRIzol购自美国MRC公司;逆转录试剂盒、Taq酶及dNTP购自美国Fermentas公司;TGF-β1,Smad7和GAPDH引物购自上海博亚生物技术公司。1.1.2实验动物清洁级雌性SD大鼠由中南大学湘雅医学院动物实验学部提供,共30只,体质量(200±20)g,生长良好,自由饮水进食,普食喂养。1.2实验方法1.2.1大鼠双侧尿激酶结扎手术模型实验大鼠适应性喂养1周后,随机分为假手术组、模型组和依那普利治疗组。模型组和依那普利治疗组大鼠均在无菌条件下在靠肾盂的部位行左侧输尿管结扎术,而假手术组大鼠仅分离左侧输尿管。依那普利治疗组大鼠于手术前1d开始以依那普利[10mg/(kg·d),溶于生理盐水]灌胃,假手术组和模型组以等量生理盐水灌胃。于术后14d处死所有大鼠。1.2.2观察指标和方法1.2.2.肾间质损伤指标大鼠处死后留取梗阻侧肾组织,常规固定、包埋、切片,HE染色观察肾组织病理变化,低倍镜下单盲依序观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾小管间质视野。按肾间质损伤8项指标评分:肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质细胞浸润,计算其均值,作为该标本的肾小管间质损伤指数。进行Masson染色观察肾组织胶原沉积,且每张Masson染色切片随机选取10个互不重叠的肾间质视野(×200),借助HPIAS-1000图像分析系统,计算每例切片肾组织Masson染色阳性面积占整个视野百分比,将Masson染色所显示的胶原相对面积作为肾组织胶原含量的评定指标。1.2.2.免疫组织中col和smad7具体步骤如下:(1)TGF-β1和p-Smad2/3∶3μm石蜡切片常规脱蜡水化后经3%过氧化氢室温孵育20min,微波修复10min,加入一抗(TGF-β1稀释浓度为1∶100,p-Smad2/3稀释浓度为1∶400)4℃过夜,自然恢复至室温,再依次加入抗原加强液37℃孵育20min及二抗37℃孵育30min(每步操作后均以PBS浸洗5min×3次);DAB显色,苏木素复染后用中性树胶封片。(2)ColⅠ和Smad7:3μm石蜡切片常规脱蜡水化后经3%过氧化氢室温孵育20min,0.2%胃酶37℃修复40min,血清封闭室温30min,加入一抗(ColⅠ稀释浓度为1∶70,Smad7稀释浓度为1∶100)4℃过夜,自然恢复至室温,滴加生物素标记的第二抗体室温孵育10min及链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液室温孵育10min(除血清封闭外每步操作后均以PBS浸洗5min×3次);DAB显色,苏木素复染后用中性树脂封片。以PBS替代一抗作为阴性对照。结果判定:(1)ColⅠ(间质阳性)、TGF-β1和Smad7(胞浆阳性)。光镜下观察棕黄色为阳性染色。参考文献的方法,在200倍光学显微镜下,每个标本随机观察15个视野,计算免疫组化阳性肾小管或间质所占视野的百分比,进行半定量评分后取均值:无阳性染色,0分;<25%,1分;25%～50%,2分;50%～75%,3分;>75%,4分。(2)p-Smad2/3(胞核阳性)。每例切片在高倍镜(×400)下随机选20个视野,计数每个视野阳性及总的细胞数,折算成每200个总细胞数中的阳性细胞数进行分析。1.2.2.pcr扩增gcagatgmf-1或smad7总RNA提取及逆转录反应按试剂盒说明书步骤进行。引物序列均根据GeneBank,用primer3软件辅助设计。TGF-β1上游引物:5′-GGACTACTACGCCAAAGAAG-3′,下游引物:5′-TCAAAAGACAGCCACTCAGG-3′,扩增产物长度294bp;Smad7上游引物:5′-TTTACAACCGCAGCATTACC-3′,下游引物:5′-AAGATGACCTCCAGCCAGC-3′,扩增产物长度273bp;GAPDH上游引物:5′-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3′,下游引物:5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′,扩增产物长度501bp。PCR反应总体积为25μL,组分如下:10×缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl22μL,10mmol/LdNTP2.5μL,5mmol/LGAPDH上下游引物各1μL,10μmol/LTGF-β1(或Smad7)上下游引物各1μL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.3μL,cDNA1μL,ddH2O12.7μL。反应条件:95℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸40s,循环35次;72℃延伸10minPCR产物于1.5%琼脂糖电泳,SYNGENE凝胶成像系统对各电泳带的光密度进行分析,计算目的基因与同管内参照GAPDHPCR产物的平均光密度的比值,即为目的基因mRNA表达的半定量结果。1.3统计处理所有实验数据以ˉx±s表示,数据分析采用SPSS11.5统计分析软件,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1肾间质损伤指数光镜下观察肾组织HE和Masson染色切片,结果发现假手术组肾组织无明显病理改变;模型组肾小管扩张,肾小管上皮细胞萎缩、空泡变性,肾间质增宽,弥漫的单核、淋巴细胞浸润,成纤维细胞增生及胶原纤维增多;依那普利治疗后上述病变减轻。HE染色切片肾间质损伤指数评分显示,模型组与假手术组比较,肾间质损伤指数明显增高(P<0.01);依那普利治疗组模型组比较,肾间质损伤指数明显降低(P<0.05),但与假手术组比较,肾间质损伤指数增高(P<0.01,表1,图1)。对Masson染色胶原含量进行半定量分析发现,模型组胶原含量明显增高(P<0.01),以依那普利治疗后,胶原沉积明显减轻(P<0.01,表1,图2)。2.2肾组织tgf-1、p-smad2/3表达假手术组肾间质内无ColⅠ表达,模型组肾间质见大量ColⅠ沉积,依那普利治疗组与模型组比较ColⅠ的表达明显减轻(P<0.05)。假手术组大鼠肾组织TGF-β1呈弱阳性表达,模型组大鼠肾组织TGF-β1表达明显增加,显著高于假手术组(P<0.01),经依那普利治疗后,TGF-β1表达明显降低(P<0.05),仅呈弱阳性表达(表2,图3)。假手术组大鼠肾组织p-Smad2/3呈弱阳性表达,模型组p-Smad2/3呈强阳性表达,经依那普利治疗,p-Smad2/3表达减弱(P<0.01,表2,图4)。假手术组肾组织Smad7表达较强,模型组肾组织Smad7表达明显减弱(P<0.01),依那普利治疗后Smad7表达较模型组增强(P<0.01,表2,图5)。2.3依那普利治疗前后tgf-m1rna表达变化结果显示:假手术组大鼠肾组织TGF-β1mRNA低表达,模型组大鼠肾组织TGF-β1mRNA表达明显增高,经依那普利治疗后,TGF-β1mRNA表达减弱(表3,图6)。假手术组大鼠肾组织Smad7mRNA呈强表达,模型组大鼠肾组织Smad7mRNA呈弱表达,经依那普利治疗后,Smad7mRNA表达增强(表3,图7)。3uui对肾组织中tgf-1和smad3表达的影响在多种病因导致肾间质纤维化的发病过程中,肾素-血管紧张素系统激活,血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)增加,AngⅡ通过自分泌或旁分泌的方式促进TGF-β1激活很可能是其中的关键环节。Smads蛋白是TGF-β1与其细胞膜上的受体结合后的胞内激酶底物,介导了TGF-β1的细胞内信号传导,TGF-β1主要通过Smads途径介导其促纤维化效应。在TGF-β/Smads通路的信号传导过程中,Smad2/3磷酸化为p-Smad2/3是关键的步骤,而Smad7作为抑制性Smad,与TGF-βI型受体结合,抑制Smad2/3的磷酸化,起负反馈调节作用。因此,本实验选用TGF-β1,p-Smad2/3和Smad7作为观察指标,来探讨ACEI抗肾间质纤维化的作用机制。ACEI通过抑制血管紧张素转化酶的活性,使AngⅡ生成减少,TGF-β1的表达下降,从而起到重要的抗肾间质纤维化的作用。Koo等发现,大鼠行UUO术后10d,即使输尿管再通,梗阻侧肾组织病变并不能完全恢复,但依那普利可促进梗阻导致的肾间质病变的恢复。ElChaar等实验证实,依那普利可以改善UUO术后14d大鼠肾间质纤维化病变,并且联合应用TGF-β1抑制剂可以起到更好的抗纤维化效果。Yu等发现,依那普利可减少抗Thy-1肾炎模型大鼠肾组织中TGF-β1的表达,改善肾组织纤维化病变。本实验结果显示,大鼠UUO术后14d,模型组肾间质纤维化病变明显,肾间质损伤指数、胶原相对面积及间质内ColⅠ表达均较假手术组明显增高,表明UUO模型建立成功;用依那普利治疗后,肾间质纤维化病变明显得到改善,肾间质损伤指数、胶原相对面积及间质内ColⅠ表达均减少,TGF-β1蛋白及mRNA的表达均降低,表明依那普利有抗肾纤维化作用,且其作用机制与抑制TGF-β1有关,与上述文献报道一致。TGF-β/Smads信号通路在肾纤维化发病机制中起重要作用,抑制该通路的信号传导有可能起到抗肾纤维化的作用。Fukasawa等发现,UUO模型大鼠梗阻侧肾TGF-β1,Smad2,Smad3蛋白表达增加,而Smad7蛋白表达下降。Inazaki等实验证明,在UUO模型中,Smad3基因缺陷小鼠与野生型小鼠相比,梗阻侧肾组织p-Smad2/3表达明显减少,肾纤维化程度明显得到改善。Lan等发现,UUO模型大鼠梗阻肾组织Smad7的表达明显减少,而Smad2和Smad3的活化增加了约6倍,将Smad7基因转染UUO大鼠后,Smad2和Smad3激活被抑制,I型胶原、III型胶原含量明显下降。另有研究结果发现,血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂氯沙坦可抑制5/6肾切除模型残余肾组织中p-Smad2/3的表达、