白芍总苷对糖尿病大鼠肾脏保护作用及部分机制研究

白芍总苷对糖尿病大鼠肾脏保护作用及部分机制研究

近年来，在糖尿病模型中的这项研究表明，使用添加剂和免疫-炎症抑制剂可减少肾脏组织过度氧化和过度炎症细胞的暴露，减少尿白，改善肾组织结构异常。然而，免疫-炎症抑制剂应应用于糖尿病肾病（dn）的临床安全。白芍总苷(totalglucosidesofpaeony,TGP)是我国传统中药白芍根中提取的有效部位,其药理作用主要有抗炎、抗氧化与免疫调节活性。在临床与动物实验中TGP已用来治疗类风湿关节炎、免疫性肝损害、系统性红斑狼疮及系膜增生型肾炎,疗效确切,无明显毒副作用。本研究进一步观察了TGP对实验性糖尿病模型肾脏保护作用及可能机制,旨为TGP应用于DN临床干预提供实验依据。1材料和方法1.1安徽医科大学动物中心提供50只昆明种SD♂大鼠,体重180～200g,安徽医科大学动物中心提供。在室温(22±2)℃、相对湿度(55±5)%、光照周期12～12h环境中适应饲养1wk后实验。1.2生化指标及药物链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)系Sigma公司产品,临用前溶解在0.01mmol·L-1枸橼酸缓冲液中,pH4.5;TGP为安徽医科大学临床药理研究所魏伟教授惠赠,用前溶于1%的羧甲基纤维素钠溶液中;尿白蛋白测定试剂盒购自法国SPI公司;丙二醛(malondiadehyde,MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;兔抗大鼠转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)多克隆抗体系SantaCruza公司产品;兔抗大鼠1α(Ⅳ)型胶原、细胞间粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)多克隆抗体、生物素标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG及链酶亲和素-生物素复合物(SABC)购自武汉博士德公司;硝酸纤维膜购自美国Amersham公司;ECL发光试剂购自Pierce公司。1.3方法1.3.1糖尿病大鼠血糖等指标检测大鼠腹腔1次性注射STZ65mg·kg1,48～72h后尾静脉采血,应用血糖仪测定全血血糖,血糖16.7mmol·L-1以上确定为糖尿病大鼠,对照组仅注射等量枸橼酸缓冲液。1.3.2tgp给药剂量大鼠随机分:对照组(n=10)、模型组(n=10)、TGP给药组(n=30)。TGP给药方法参考文献,选择50、100、200mg·kg-1·d-1灌胃给药,对照组和糖尿病组给予等量溶媒。所有大鼠在整个实验期间喂标准饮食,自由饮水,不应用胰岛素,观察8wk。1.3.3肾组织病理学检测大鼠处死前1天放入代谢笼(苏州新区枫桥实验动物笼具厂产品)中准确收集24h尿液,离心分装后保存于-70℃冰箱中待测尿白蛋白和肌酐含量。然后在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右侧颈总动脉插管收集血标本,4℃离心取血浆保存于-20℃待测血糖、肝功能、肾功能和血脂水平。通过右侧颈总动脉插管注入4℃预冷的生理盐水反复灌洗肾脏,至整个肾脏颜色变苍白后游离,置于冰上,取8mm3大小肾组织置于4%多聚甲醛溶液中固定,石蜡包埋,制成厚度为4μm切片,行PAS染色。同时制3μm多聚赖氨酸处理切片,进行免疫组化研究。剩余肾组织分别切成小块,置于液氮中,冻透后转入-70℃冰箱中待测。1.3.4尿白蛋白含量与24h尿量累积计算采用EIA测定尿白蛋白含量,24h尿白蛋白排泄率(albuminexcretionrate,AER)为尿白蛋白含量与24h尿量乘积;内生肌酐清除率(Ccr)按照下列公式计算:Ccr(ml·min-1100gBW)=Ucr(mg·dl-1)×V(ml)×1/Scr(mg/dl)×1/1440(min)×1/BW(g)×100,其中Ucr、Scr、V和BW分别代表尿肌酐、血肌酐浓度、24h尿量与体重。1.3.5肾脏组织中的mda含量采用硫代巴比妥显色法,按照试剂盒说明书操作。1.3.6肾-间质面积PAS染色切片高倍镜(×400)下随机选择30个肾小球与30个肾小管-间质(无肾小球与血管),应用病理图像分析系统软件(北京航空航天大学开发)测定平均面积(AG)与肾小管-间质面积。肾小球平均容量(VG)按下列公式计算:VG=β/K(AG)3/2,其中β=1.38,为大小分布系数;K=1.1,为球形系数。所测肾小管-间质面积按以下标准评分:0:正常;1:间质炎症与纤维化、肾小管萎缩与扩张伴管型形成<25%所测区域;2:损伤面积在25～50%所测区域;3:损伤面积>50%所测区域。肾小管-间质损伤指数(indicesfortubulointerstitialinjury,TII)为以上各积分中位数。1.3.7sds-东南角电泳mg肾组织置入裂解液(0.1mol·L-1NaCl,100mmol·L-1Tris-HCl,10mmol·L-1EDTA,100mg·L-1PMSF,2mg·L-1Leupeptin)0.25ml匀浆,4℃12000×g离心2min,取上清测蛋白浓度。取30μg蛋白煮沸5min后,经6%SDS电泳,电转移至PVDF膜上,在5%脱脂奶粉-PBST溶液室温下封闭1h,洗膜后加入兔抗大鼠1α(IV)型胶原抗体(1∶1000)或ICAM-1抗体(1∶2000)4℃过夜,再用HRP标记的二抗杂交,37℃,1h。洗膜后在暗室中加ECL发光试剂,X光胶片曝光1～2min后显影、定影,杂交信号在图像分析系统中进行光密度扫描。应用管家基因β-actin作为蛋白上样量对照,其余组与其相比得到相对量,取均值。1.3.8小鼠肝肾免疫组化采用SABC方法:切片常规脱蜡,用3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化酶,应用微波炉暴露抗原后封闭内源性生物素。加兔抗大鼠TGFβ1(1∶100)多克隆抗体,4℃过夜,再加生物素化羊抗兔IgG(1∶200),室温30min,滴加SABC,室温30min,滴加DAB显色液,镜下控制着色时间。实验采用删除第一抗体作阴性对照。阳性物质呈棕色颗粒状,肾小球TGFβ1免疫组化结果判断按下列方法进行半定量评分:0=微弱或无染色;1=染色面积<25%;2=染色面积25%～50%;3=染色面积50%～75%;4=染色面积>75%。肾小管-间质TGFβ1免疫组化结果判断应用图像分析系统,计算其阳性面积占肾小管-间质面积百分比(%),取均值进行比较。1.3.9免疫组化半定量评分tgf1正态分布资料以ˉx±s表示。AER为非正态分布资料,采用对数转换后,用几何均数×/÷耐受因子(geometricmean×/÷tolerancefactor)表示。TII及肾小球TGFβ1免疫组化半定量评分为非正态分布资料,采用中位数表示。应用SPSS11.0软件包进行统计分析,参数资料采用One-WayANOVA检验,非参数资料中采用Kruskal-Wallis检验。2各组大鼠血脂指标比较模型组大鼠表现为血糖升高、体重下降、相对肾重(肾重/体重)增加,TGP(50,100,200mg·kg-1)给药8wk没有防止模型组大鼠血糖升高与体重下降。TGP(50,100,200mg·kg-1)给药组大鼠相对肾重与模型组相比有所下降,但差异无统计学意义。模型组大鼠AER明显高于对照组,TGP(50,100,200mg·kg-1)给药8wk大鼠AER水平明显低于模型组。模型组大鼠Ccr明显低于对照组,TGP(50,100,200mg·kg-1)给药组Ccr水平与模型组相比无差异(Tab1)。模型组大鼠血TC、TG水平明显高于对照组,TGP(50,100,200mg·kg-1)给药组血TC、TG水平与模型组相比无差异。另外,模型组、各给药组与对照组相比,血谷丙转氨酶、谷草转氨酶无明显变化,提示TGP对肝功能指标无明显影响(Tab2)。模型组大鼠VG与TII明显高于对照组,提示本模型大鼠已出现肾小球肥大与肾小管-间质损害;TGP(50mg·kg-1)给药组大鼠VG明显低于模型组,TⅡ较模型组有所下降,但差异无统计学意义,TGP(100,200mg·kg-1)给药组VG与TⅡ均明显低于模型组(Fig1)。模型组大鼠肾组织MDA含量明显高于对照组;TGP(50,100mg·kg-1)给药8wk肾组织MDA含量与模型组相比无明显差异,TGP(200mg·kg-1)给药组肾组织MDA水平明显低于模型组(Fig2)。Westernblot条带光密度分析显示模型组肾组织1α(IV)型胶原蛋白表达较对照组增加2.7倍,TGP50,100,200mg·kg-1给药8wk可使肾组织1α(IV)型胶原蛋白表达分别下降47.9%、60.4%与72.9%(Fig3)。Westernblot条带光密度分析显示模型组肾组织ICAM-1蛋白表达较对照组增加3.9倍,TGP(50,100,200mg·kg-1)给药8wk可使肾组织ICAM-1蛋白表达分别下降39.2%、72.7%与83.8%(Fig4)。免疫组化显示对照组大鼠肾小球与肾小管-间质有微弱TGFβ1蛋白表达,模型组肾小球与肾小管-间质TGFβ1蛋白表达明显高于对照组,TGP(50mg·kg-1)给药组肾小球与肾小管-间质TGFβ1蛋白表达低于模型组,但差异无统计学意义,TGP(100,200mg·kg-1)给药组肾小球与肾小管-间质TGFβ1蛋白表达明显低于模型组(Fig5)。3tgp治疗糖尿病肾组织其他指标的活性本实验应用STZ诱导大鼠糖尿病模型,8wk后大鼠出现体重与Ccr下降、相对肾重、肾小球体积、肾小管-间质损伤指数、尿白蛋白排泄率及ECM成分1α(IV)型胶原表达增加,提示本模型已出现DN早期表现。TGP给药8wk对糖尿病大鼠血糖、体重及Ccr无明显影响,呈剂量依赖性改善肾脏病理损害、减少尿白蛋白排泄率及1α(IV)型胶原集聚,我们的研究表明TGP对实验性早期DN有明显保护作用,我们进一步探讨了TGP对DN保护作用可能机制。现代研究表明,TGP主要含有芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等成分,近年来,体内外研究表明TGP主要药理作用有抗炎,抗氧化和免疫调节方面的活性。近年国内学者证实在佐剂性关节炎(AA)大鼠模型中TGP可以通过抑制类巨噬细胞的滑膜细胞产生前炎症介质如白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNFα)表达发挥抗炎作用,也可通过抑制类纤维母细胞的滑膜细胞分泌血管上皮细胞生长因子(VEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)而抑制新生血管生成。由于以巨噬细胞介导的肾内炎症是DN进展的关键因素之一,近年,我们与其他学者分别应用不同的免疫抑制剂如霉酚酸酯、氨甲喋啶、咪唑立宾干预糖尿病模型,发现均可明显减轻肾脏病理损害与尿白蛋白排泄率增加,其机制主要为抑制肾内巨噬细胞浸润。我们现在的研究没有观察TGP对糖尿病肾内巨噬细胞浸润的影响,但证实TGP呈剂量依赖性抑制糖尿病肾组织ICAM-1高表达。ICAM-1是一种细胞表面糖蛋白,它可充当α1β2整合素(LFA-1)配体,介导白细胞黏附与迁移。多种肾组织细胞包括系膜细胞、血管内皮细胞、肾小管-间质细胞表达ICAM-1,在炎症部位ICAM-1表达明显上调。Okada等利用ICAM-1-/-小鼠建立STZ诱导的糖尿病模型,发现小鼠尿白蛋白排泄率、肾小球肥大、系膜基质扩张明显减轻,肾脏巨噬细胞浸润、TGFβ1与1α(IV)型胶原表达明显减少。我们现在的研究表明TGP可能是通过抑制糖尿病肾组织ICAM-1表达相应地抑制肾组织巨噬细胞浸润,其机制有待进一步研究。另外,在糖尿病肾脏损伤过程中,多种的途径交织在一起如多元醇途径,己糖胺途径,NF-κB的活化,终末期糖基化产物的增加,血管紧张素Ⅱ合成增多以及蛋白激酶C(PKC)途径的激活。这些途径有一条共同的通路,即氧化应激增加致氧自由基产生增多,大量研究表明抗氧化剂对糖尿病肾脏有明显保护作用。晚近,在大鼠全脑缺血再灌注及免疫性肝损伤模型中证实TGP可降低损伤组织脂质过氧化物MDA水平、增加抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)与谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性而发挥抗氧化作用,我们现在的研究表明TGP(50、100mg·kg-1)给药没有降低糖尿病肾组织MDA水平,但200mg·kg-1给药可明显降低糖尿病肾组织MDA水平,提示TGP大剂量给药对糖尿病肾组织有抗氧化作用。TGFβ1为DN发病过程中肾小球与肾小管-间质损害最为肯定的生长因子,一些体内外研究中对DN的保护药物往往以此为评价,DN发病过程中各种损伤介质最终是通过诱导TGFβ1增加致肾脏损害。我们的研究同样证实TG