第八章 微生物的遗传变异和育种

第八章微生物的遗传变异和育种遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；是一种内在可能性或潜力。

遗传型+环境条件表型表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。代谢发育变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（一般为10-6～10-10）；b.形状变化的幅度大；c.变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。例如：粘质沙雷氏菌：在25℃下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37℃下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25℃，又恢复产色素的能力。遗传与变异的概念Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens.

Fromlefttoright:slantculturegrownat25°C,slantculturegrownat37°C,brothculturegrownat25°C,brothculturegrownat37°C.

表型饰变：粘质沙雷氏菌微生物的独特生物学特性：（1）物种和代谢类型的多样性（2）个体的体制极其简单；（3） 营养体一般都是单倍体；（4）

易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（5）

繁殖速度快；（6）

易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（7）

菌落形态特征的可见性和多样性；（8）

环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（9）

易于形成营养缺陷型；（10） 各种微生物一般都有相应的病毒；（11）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；微生物是遗传学研究中的明星！微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。研究微生物遗传学的意义第一节遗传变异的物质基础种质连续理论：1883~1889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：1933年摩尔根（ThomasHuntMorgan）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列、组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因的活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。1、经典转化实验肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）一、证明DNA（RNA）是遗传物质的三个经典实验1928年，F.Griffth作了3组实验:1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子实验证明：将R菌转化为S菌的转化因子是DNA!2、T2噬菌体感染实验19523、植物病毒重建实验1956实验证明，核酸才是负载遗传信息的真正物质基础！二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式（一）遗传物质在7个水平上的形式1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的2、细胞核水平真核生物细胞核核染色体原核生物核区DNA链在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质核基因组3、染色体水平染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构染色体的数目在不同的生物中是不同的染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位（二）微生物基因组结构的特点1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数，一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短；个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；4）重复序列多。3、原核生物和真核生物的基因组比较QUESTION证明DNA（RNA）是遗传物质的三个经典实验分别是什么？（三）原核生物的质粒1、定义质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；

(细菌质粒多在10kb以内)2、结构特点3、质粒的类型严谨型质粒(stringentplasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数松弛型质粒(relaxedplasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)（可以在许多种宿主细胞中复制）4、质粒在基因工程中的应用质粒的优点：（1）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定（3）独立复制（4）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选E.coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体5、质粒的检测提取所有胞内DNA后电镜观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。6、几种代表性质粒

F–因子（fertilityfactor）：又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。Figure.RepresentativeFERTILITYPLASMID.Afertilityplasmidcarriesthegenesforconjugationaswellasanumberofothergenes.Inthisfigurethefertilityplasmidalsocarriesantibioticresistantgenes.最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性决定因子（r-determinant），RTF为分子量约为11×106Dalton，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100×106Dalton以上。其上带有抗生素的抗性基因。R-因子在细胞内的copy数可从1~2个到几十个，分为严谨型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000~3000个/细胞。R因子（resistencefactor）产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约4×104~8×104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。ColE1分子量约为5×106Dalton，无接合作用，是多copy的；ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA的研究和用于体外复制系统上。ColIb分子量约为80×106Dalton，它与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严谨型控制，只有1~2个copy。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌有免疫作用，不受其伤害。Col因子（colicinogenicfactor）常在假单胞菌属（Pseudomonas）中发现。降解性质粒可为一系列能降解复杂有机物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。4.降解性质粒即诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium

tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。

Ti质粒（tumorinducingplasmid）Ti质粒中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200~300×106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。巨大质粒（mega质粒）第二节基因突变和诱变育种简称突变，是指细胞内（或病毒粒子内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。基因突变狭义：点突变广义：点突变和染色体畸变野生型（原始性状）基因突变突变型（新性状）一、基因突变表型基因型野生型菌株突变菌株（一）突变类型基因突变按表型特征分：1）营养缺陷型（auxotroph）一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段表型判断的标准：在基本培养基上能否生长（一）突变类型营养缺陷型特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长负选择标记突变株不能通过选择平板直接获得营养缺陷型的表示方法：基因型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，C同一表型中不同基因的突变）表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。2）抗药性突变型（resistantmutant）基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。特点：正选择标记在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示：strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性3）条件致死突变型（conditionallethalmutant）

在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperaturesensitive）表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25-30℃）下得到这种突变。特点：负选择标记这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因4）形态突变型（morphologicalmutant）造成形态改变的突变型特点：非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。举例：产蛋白酶缺陷突变株的筛选菌落颜色变化β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。形成芽孢缺陷菌株细胞水平上的形态突变，突变株的检出更加困难。5）抗原突变型由于突变引起的细胞抗原结构发生变异的类型。细胞壁缺陷变异荚膜、鞭毛成分变异6）产量突变型通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变。正突变（plusmutant）负突变（minusmutant）细胞或病毒在每一世代中，某一性状发生突变的几率。（二）、突变率（mutationrate）一般基因的自发突变率为百万分之一1）自发性2）非对应性3）稀有性4）独立性5）可诱变性6）稳定性7）可逆性（三）、基因突变的特点基因突变自发产生突变性状与突变原因不对应突变性状是可以通过再次突变回复的突变基因的性状是稳定的诱变剂可大大提高突变率不同基因的突变互不影响自发突变几率低（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明三个经典实验变量实验涂布实验影印实验证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因无直接对应关系。特定环境野生型（原始性状）突变型（适应环境的新性状）驯化定向诱变筛选？？？突变的原因？？（五）基因突变及其机制诱变自发突变(1对碱基)(一段)1、诱发突变（诱变）：

通过人为的方法，利用物理、化学或生物的因素，提高基因自发突变率的手段。诱变剂：具有诱变效应的任何因素。诱变剂物理非电离辐射紫外线激光离子束电离辐射X射线γ射线快中子化学烷化剂碱基类似物吖啶化合物NTG、EMS、DES氮芥、环氧乙酸乙烯亚胺致癌剂（1）碱基的置换碱基置换引起的突变碱基变化与遗传信息的改变(1)同义突变(same-sensemutation)这是指某个碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的密码子变化，显然，这是与密码子的简并性相关的。(2)错义突变(mis-sensemutation)

是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至使之完全无活性，从而影响了表型。如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变(lethalmutation)。(3)无义突变(nonsensemutation)是指某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子(UAA，UAG，UGA)。蛋白质的合成提前终止，产生截短的蛋白质。

（2）移码突变

指DNA序列中增添或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。 一些吖啶类染料与嘌呤-嘧啶对十分相似，可引起移码突变。(3)染色体畸变 强烈的理化因素引起DNA分子的大损伤，包括缺失、重复、插入、易位、倒位，以及染色体数目的变化。2、自发突变：指不经过诱变剂处理而自然发生的突变。自发突变的可能机制背景辐射和环境因素的诱变微生物自身有害代谢产物的诱变效应DNA复制时出错（六）紫外线对DNA的损伤及其修复嘧啶嘧啶二聚体UV1、光复活作用嘧啶二聚体嘧啶光解酶2、切除修复二、突变与育种（一）自发突变与育种

生产中选育定向培育（二）诱变育种1、诱变育种的基本环节2、诱变育种的原则（1）使用简便有效的诱变剂诱变剂物理因素化学因素紫外线激光离子束X射线r射线快中子烷化剂碱基类似物吖啶化合物Ames试验：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用；90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。

美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验。具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。证明Ames试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在20世纪60-70年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用。但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免，（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量剂量=强度（浓度）×作用时间相对剂量=杀菌率（5）利用协同效应（6）寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标（7）设计高效率筛选方案（8）根据具体情况创造新型筛选方案3、突变株的筛选：（1）产量突变株的筛选（2）抗药性突变株的筛选（3）营养缺陷型突变株的筛选（3）营养缺陷型突变株的筛选第三节基因重组和杂交育种基因重组：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。重组与杂交的关系：重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交。而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexualhybridization）等及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。一、原核生物的基因重组基因重组的方式转化转导接合原生质体融合(一)转化作用的发现有荚膜，致病一、转化

R型活菌+S型死菌→→S型活菌转化：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为。转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。有关名词：受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者供体菌：donor，转化基因的提供者转化因子：来自供体菌的DNA片段转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子①受体细胞要处于感受态.感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态②供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1×107

D

左右③菌株间的亲缘关系密切2、转化发生的条件：3、转化的类型：根据感受态建立的方式，可以分为：①自然遗传转化②人工转化(二)自然转化作用1.感受态的出现感受态：细菌能从周围环境中吸取DNA的生理状态称为~，是细菌生长到某一特定阶段的一种生理特性，这时细菌表面出现许多双链DNA结合位点。感受态的出现与遗传和环境都有关系。DNA结合蛋白核酸酶感受态特有的单链DNA结合蛋白(二)自然转化作用2.双链DNA的结合和进入3.DNA的整合转化过程：降解吸附切割成4~5×106单链入胞同源部分配对、整合复制分裂，只有一个子代DNA分子获得供体基因非转化子转化子(三)人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。(三)人工转化1.大肠杆菌的转化(Ca2+介导的转化)大肠杆菌50~100mmol/LCa2+感受态外源DNA42℃热激转化子冰浴20~40min质粒携带外源DNA进入细胞的转化过程(三)人工转化2.PEG介导的转化枯草芽孢杆菌等渗溶液质粒DNA转化子溶菌酶PEG(三)人工转化3.电转化电场脉冲使细胞膜形成小孔，外源DNA片段趁机进入细胞的过程。转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA供体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染(transfection)：转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。二、细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传物质交换的一种方式一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。细菌转导的类型：普遍转导局限转导完全普遍转导流产普遍转导低频转导高频转导局限转导与普遍转导的主要区别溶源转变三、接合(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传物质的转移和重组过程。1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验Met+bio+thr+leu+Met-bio-thr+leu+Met+bio+thr-leu-[-][-][-]混合培养中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）接合机制(大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。F因子为附加体质粒，既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上。F因子的四种细胞形式a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)，

F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。1）F+×F-杂交理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。a）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；b）F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的F因子。d）复制完成后，F-细菌变成F+，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。所以最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。2）Hfr×F-杂交Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被切口酶－螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-重组子中出现的时间就越早，频率也高。中断杂交（interruptedmating）技术利用Hfr×F-的接合过程，在不同时间取样，并把样品搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。大肠杆菌基因组全部转移需要100分钟。其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成。大肠杆菌遗传图谱3）F′×F-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段核染色体基因的F因子，特称为F′因子。F′×F-与F+×F-的不同：供体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；以F′因子转移供体基因过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediatedtransduction）。“接合”“转导”及“转化”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：外源DNA的来源及进入途径有差异原生质体融合：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（fusant）的过程。适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。意义：20世纪70年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。四、原生质体融合原生质体融合的主要步骤：选择亲株 →制备原生质体→原生质体融合→原生质体再生→筛选优良性状的融合重组子二、真核微生物的基因重组主要方式：有性杂交准性杂交原生质体融合（略）转化（略）（一）有性杂交：一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。细胞（＋）细胞（－）有性接合染色体重组新遗传型能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交（二）准性杂交：类似于有性生殖但更原始的生殖方式，是通过同种两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。细胞（＋）细胞（＋）准性接合基因重组新遗传型菌丝联结质配核配有丝分裂交换单倍体杂合子在半知菌类中最为常见半知菌的准性生殖准性生殖的过程：①菌丝联结②异核体形成（质配）③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化。准性杂交：选择亲本：以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本。强制异合：将两菌亲株的分生孢子（106~107）混合涂[-]平板，并做各单亲本对照，[-]平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体。移单菌落：纯化菌落，并将纯化后的菌落移入[-]斜面。验稳定性：在[-]夹层平板上培养后，再倒上一层[+]，再培养后若出现大量新菌落，说明是不稳定的异核体，反之是杂合二倍体促进变异：用诱变剂进行处理，以促进染色体发生交换、染色体在子细胞分配不均、染色体缺失或畸变、点突变等，使分离后的子代提高增加新性状的可能。筛选：准性杂交育种第四节基因工程特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性一、基因工程定义：在基因水平上，改造遗传物质，从而使物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的生物新品系。获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入受体细胞筛选和鉴定应用二、基因工程的基本操作第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：

a）变异；b）污染；c）死亡。一、菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变纯菌种自发突变不纯菌种突变个体传代增殖原始个体衰退菌种衰退：菌种出现或表现出负变性状1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。

a）纯种分离；

b）通过寄主体进行复壮；2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。菌种的复壮：二、防止衰退的措施1）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；3）利用单核体传代;4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法。三、菌种保藏目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种；2、尽量使用分生孢子、芽胞等休眠体；3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）；4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌种。基本方法培养基传代培养（斜面、平板）寄主传代培养低温（液氮、低温冰箱）干燥（沙土管、真空干燥）生活态休眠态冷冻干燥保藏法和液氮保藏法作业1