分子生物学研究(A)

分子生物学方法应用于血吸虫病研究的进展刘述先（中国CDC寄生虫病所，上海200025）分子生物学从分子水平研究生命活动及其规律的科学。是近50年发展起来的门新学科。WatsonJD&CrickF（1953）阐明DNA双螺旋结构作为开创分子生物学的里程碑。核心内容是通过对蛋白质，酶，核酸等生物大分子的结构和功能的研究来探索生命现象的本质。巨大进展，最深远的和革命性的进展，在核酸研究方面有30余人次获得诺贝尔化学奖，生理学和医学奖。包括：—对肌红蛋白等蛋白质一级结构及功能的研究—阐明DNA双螺旋结构—测定酵母tRNA的一级结构，进而建立测定DNA的序列的方法—发现并合成遗传密码—创立基因对酶和病毒合成控制的操纵子学说—阐明基因结构和病毒复制机制—发现反转录酶，细菌限制性内切酶等—建立DNA重组技术，等等。分子生物学方法日新月异，分子生物学技术不断发展和完善，并迅速，广泛地渗透到生命科学的各学科。分子生物学方法应用于血吸虫病的研究进展迅速，主要在：—血吸虫种株遗传变异及分类研究（包括中间宿主螺在内）；—血吸虫基因组计划实施；—抗血吸虫新药标靶搜寻；—血吸虫病新诊断方法探索及老诊断方法改进；—血吸虫疫苗的研制；应用于研究血吸虫种株遗传变异及分类：报告较多，常见的归纳于下；1.特异性核酸探针杂交技术；2.核酸限制性酶切片段长度多态性技术(RELP和PCR-RELP）;3.随机扩增多态性DNA技术（RAPD）;4.线粒体DNA(mtDNA)酶切片段长度多态性分析技术;5.简单重复序列锚定PCR技术(SSR-PCR);6.代表性差异分析技术(RDA)1.特异性核酸探针杂交技术Simpson等（1984）用BamH1将Sm基因切成三片段，并用PBR322质粒克隆，重组质粒中显示有4.4kb(pSM889)，3.1kb(pSM389)，和2.4kb(pSM890)三个插入片段，用同位素标记制备成探针，与限制性内切酶消化的血吸虫基因组DNA进行杂交，对血吸虫的遗传变异和系统发育进行一系列研究，发现Sm，Sh，Sj，之间RELP有明显差异。应用克隆的SmrDNA基因片段制成探针pSM389，pSM889和pSM890，Southern印迹分析血吸虫DNA进行种株分类和性别鉴定。应用探针pSM750快速鉴别14个Sm地域株，用RELP进行种内遗传变异的研究，发现有鉴别意义的带型。应用pSM889探针对Sj5个地域株DNA分析，其DNA主带一致，次带相异。2.核酸限制性酶切片段长度多态性技术(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RELP)RELP：DNA酶切后，经电泳将酶切片段分开，形成RELP图谱将分开的DNA片段转移至固态支持物上,用标记探针检测,分析。PCR-RELP：以PCR扩增出DNA，酶切，电泳，溴乙锭染色观察带型，无需印迹和杂交步骤。PCR-RFLP(ng)比传统RFLP分析(μg)所需DNA量明显减少，模板DNA量微，质量要求也不高,可用于分类，流行病学研究和诊断。局限性：需事先获得目的基因或序列的信息，方能准确设计相应的特异性引物。Rollinson等(1986)用内切酶/Sm和另外6种血吸虫DNA，产生酶切片段，再转移杂交，显示各虫种之间的差异。Viera等(1991)研究Sm美洲不同地域株rDNA基因RFLP。发现地域株间存在差异。3.随机扩增多态性DNA技术(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD）由William等（1990）和Welsh等（1990）发展的一种基于PCR的基因分析方法，又称为任意引物PCR。（Arbitraryprimer-PCR，AP-PCR）特点：短而非特异随机寡核苷酸序列为引物，引物与模板DNA多个位点结合，造成未知名区域扩增。不同物种基因组经随机引物扩增后产生的DNA片段显示不同的指纹图谱，称之为多态性。一旦物种基因序列发生改变，所扩增出的多态性指纹图谱就发生相应变化RAPD已较多应用于血吸虫遗传学及分类学的研究。例如：Neto（1993）首先用RAPD对8种血吸虫和5株Sm分析，分别在种株间呈现RAPD指纹图谱多态性差异。Bowle等（1993）用RAPD研究Sj大陆株和菲律宾株及其与湄公血吸虫差别，结果表明种间有差异，株间无差异。RAPD技术在媒介和中间宿主分类鉴定中的应用，不再详述。4.线粒体DNA酶切长度多态性分析线粒体DNA（mtDNA）的进化明显较核DNA快，由母系遗传不会发生重组，mtDNA序列的变化可反映生物种群内和群体间的遗传变异。Depre等比较3株Sm的mtDNA，发现在长度上和两种限制酶图谱上有很大差异。LeTH等（2000）在《人体血吸虫线粒体DNA序列目前的状况》认为通过PCR和直接测序，获得Sj和Sm的细胞色素C氧化酶亚基1（COl）基因的372bp的片段和Sj尼克酰胺脱氢酶复合物1（ND1）基因的474bp的片段，并比较了Sj不同分离株的CO1和ND1基因，发现变异率很低。5.简单重复序列锚定PCR技术

(SimpleSequenceRepeatAnchoredPCR,SSR-PCR)是基于微卫星DNA（MicrosatelliteDNA）研究发展的新技术。微卫星也称简单重复序列或短串联重复序列，以1-6个碱基为核心，单位串联重复排列而成的一类DNA序列。由于该序列种类多，分布广，高度多态，因而很快成为核酸基因遗传标志而广为应用。SSR-PCR针对高度密集重复序列，设计与之互补寡核苷酸作单引物扩增其重复片段，以观其多态性。

Olivera等（1997）对2株Sm进行SSR-PCR分析，所得结果与RAPD和RELP一样，显示其多态性差异。SSR-PCR不仅具有RAPD的优点，而且复演性佳。多种血吸虫种和株只需一种引物，从而简化研究种株差异及分类程序。可以认为基于微卫星DNA的SSR-PCR是研究血吸虫种株间遗传变异基因信息的新技术。6.代表性差异分析

(RepresentationDifference

Analysis,RDA)是一种能有效的识别基因组间差异的方法，即能分离出复杂基因组中突变或特有的基因片段（Lisitsyn等，1993）。RDA已应用于许多研究领域，特别是肿瘤基因的研究。也有将感染源的DNA与非感染的DNA进行RDA，可发现与感染有关的致病基因。Drew等（1995）年用RDA分离曼氏血吸虫雌虫特异性序列成功，使这一技术在研究血吸虫病“与某一特征相关的多态性标志的分离”上发挥作用。

差异表达基因方法由于外部环境的影响和遗传物质自身变异所导致的基因改变而产生的基因表达差异是生物进化及遗传疾病的基础。应用分子生物学方法，差异表达基因的寻找，鉴定和分析，不仅可作为生物分类依据，分析复杂但高度相关基因组间差异，还可作为疾病诊断依据(1)mRNA差异显示技术(mRNAdifferentialdisplay,mRNADD)

真核细胞中mRNA(模板)+寡聚核苷酸Oligo(dT)(引物)

反转录与mRNA互补的cDNA

+随机引物（掺入同位素标记核苷酸)

PCR扩增

DNA测序胶上电泳

放射自显影

可分辩出两种细胞来源，长度为100-500bpcDNA条带差异优点：方法简单、快速，适用于微量RNA

缺点：假阳性率高，差别条带短小

(2)代表性差异分析(Representationaldifferenceanalysis,RDA)

两种细胞基因

加一种识别4个碱基序列的限制酶

形成平均长256bpDNA片段

加接寡聚核苷酸接头（adaptors）

PCR扩增驱动扩增子(driveramplicons)

待试扩增子(testeramplicons)

接头切除

在待试扩增子5‘端加新接头

两种扩增子杂交

新接头为引物，PCR扩增

待试样品DNA与引物配对，指数扩增

待试样品单纯DNA和驱动样品单链DNA(模板)仅一端有引物,仅呈线性扩增3.抑制消减杂交法(Suppressionsubtractivehybridization,SSH)抽样两种细胞mRNA

反转录

cDNA

限制性酶切大小适当平末端cDNA

待试样品(tester)1+接头A+驱动样品(driver)

待试样品(tester)2+

接头B+驱动样品

杂交杂交分子(单链testercDNA

自身退火双链testercDNA

异源双链

DrivercDNA)RDAI

驱动子,检测子制备和扩增（含有目的序列的样本称检测样本,不含目的序列但与检测样本高度相关的样本称驱动样本）样品DNA(呈极小)

限制性内切酶2-5kb片段+

Adaptor1PCR

大量驱动子,检测子II.反复交替的杂交筛选

全部驱动子,检测子

酶切,除adaptor1

检测子加新的非磷酸化寡核苷酸adaptor212bP寡核苷酸链-‘3检测子5’-24bp寡核苷酸链+大量驱动子

变性、退火，杂交二种纯合双链一种杂合双链

+24bp作引物寡核苷酸作引物+Taq

PCR检测子与互补的驱动子形成杂合检测子不同中于驱动子DNA片段双链（仅一端带有引物序列)自我退火（self-reannealing)

形成两端均带有长寡核苷酸序列的纯合双链（homoduplexes）（两端均不带引物序列）

选择性扩增纯合双链进行指数扩增(含有目的片段高度纯化,浓度明显增高107)

血吸虫基因组计划实施1.概况：2003年底将完成人类基因组全部序列的测定（见人类基因组计划HGP）血吸虫基因组计划1994年得到WHO/UNDP/TDR资助后进展较快。血吸虫基因组较大270Mb，60%为高度或中度重复序