第八章 Prok基因表达调控

第8章Prok基因表达的调控第一节相关概念及操纵元调控花式概述第二节乳糖操纵元（LacOperon）第三节TrpOperon及弱化作用机理第四节基因转录的时序调控第五节Prok.翻译水平的调控第六节DNA序列重排对基因转录的调控第一节相关概念及

操纵元概述代谢调控过程是自身生存和繁衍所必须Prok.和Euk.都有各自准确调节基因表达的机制基因表达(geneexpression):基因表达调控(generegulationorgenecontrol):任何影响基因转录过程和翻译过程的开启、关闭和这两个过程速率的较为直接的因素及其作用涉及：RNA转录的开/关，数量，选择性加工蛋白质翻译速率，数量，加工与降解和分泌…Prok.和Euk.的调控极其相似调控机制：核酸分子间的互作核酸与蛋白质分子间的互作蛋白分子间的互作调控层次：DNA水平的调控

转录水平上的调控

转录后水平的调控（mRNA加工成熟水平上的调控）翻译水平上的调控翻译后水平的调控共同的起源与共同的分子基础●

转录水平上的调控是最为经济,灵活，又是最为重要，复杂的调控a、在复杂的基因组内，确定需要基因转录的起始位点b、精细调节基因表达的水平,以保证生物体对环境的适应c、cisfactor&transfactor间严格而又灵活的互作d、保证RNApolymerase的进行式转录（不中断，准确终止）●

生物遗传信息的概念GenomeDNA10%;结构基因的编码序列tripletcodon90%;重复，间隔，调节序列…基因选择性表达指令重要的遗传信息遗传信息的两大类别II类；特定DNAseq.+特定蛋白质/核酸结合基因表达的指令geneon/offI类；DNAseq.RNAseq.(codon)aaseq.protein表型(centraldogma)

内在信息内,外(信号分子)结合信息

ORFonlyHelix,Nt

seq….遗传信息存在于模版链三维空间结构/DNA序列的一级结构上(IR,Box,paracodon…)三联体密码空间，调控密码(钥匙与锁)简并简并摇摆同工受体cis1trans2cis2trans1cis1trans3cis3I类II类

表达specificalbindingaabaseDNARNAprotein●遗传信息表达的方式（Euk.）组成型表达（constitutiveexpression）Housekeepinggene诱导型表达（inducibleexpressionbysignalingmolecular）Luxurygene顺、反因子间互作方式的基因表达调控♫顺式作用元件（cis-actingelement）:对基因表达有调节活性的DNA序列，只影响与其同处一个DNA分子或物理上相连的DNA上的基因♫反式作用因子（trans-actingfactor）:与顺式作用元件相互作用影响基因表达的蛋白因子，其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不一定在同一个DNA分子上●操纵元(Operon):Prok.中,基因表达调控的一个完整单元,包括结构基因和控制区(O、P)以及调节基因的整个核苷酸序列♫操纵元中各结构基因按一定比例协调翻译♫具有极性突变效应：操纵元中一个近基因的无义突变能够影响远基因表达，且根据距离远近呈极性梯度效应♫P、O紧密连锁或彼此重叠，I基因位点不固定（顺式作用元件、反式作用因子）●正调控系统:没有调节蛋白存在时，结构基因是关闭的，而加入有活性的调节蛋白后,结构基因的表达活性被开启无辅基诱导物或激活物●负控制系统:没有调节蛋白存在时，结构基因是开启的，加入这种有活性的调节蛋白后，结构基因表达活性被关闭阻遏蛋白●所谓“关闭”指表达水平很低本底水平的基因表达(1～2个mRNA分子／细胞周期)“开启”也常有程度的差异●操纵元的调控体系负调控系统正调控系统诱导阻遏●基因表达调控的分子机制1、调控蛋白质的对称性与其识别序列的对称性调控蛋白都是同种分子的多聚体－－二聚体、四聚体

二倍旋转对称通过单体和多聚体间的平衡迅速作用于特异识别位点之间提高调控作用的特异性（反向重复序列）inmajorgroove特异和非特异结合力2、调控蛋白的DNA结合结构域的主要花式主要有：α螺旋-转角-α螺旋（HTH）Cys-Cys锌指Cys-His锌指调控蛋白上存在与DNA和其它蛋白质相互作用的位点

★α螺旋-转角-α螺旋*两个α螺旋被一个β转角隔开*一个螺旋起识别结合DNA的作用3个—helix,H1与H2平行H2与H3形成HTHmotifH3位于大沟中，与DNA特异结合CⅠ蛋白N端有五个螺旋,螺旋2和3与DNA相互作用C端负责二聚体形成N端负责与DNA接触★锌指结构概念:与DNA结合的蛋白质中一小组保守AA与一个Zn2+结合起来形成蛋白质中一个相对独立的结构域按结合的AA不同有两种类型a、Cys-His(C2/H2)锌指经典的锌指蛋白中部芳香族氨基酸保守，加上Zn＋＋和Cys和His之间的配位结构形成疏水核经典的锌指蛋白、类固醇受体（激素）不同锌指蛋白中锌指数目多少不等锌指可以串联重复排列，两指间7-8aaTFⅢA有9个锌指、通用转录因子SP1有三个经典锌指的三维结构：一个β－折叠和一个α－螺旋锌指上的α－螺旋负责与DNA作用b、Cys-Cys(C2/C2)锌指类固醇受体Zn＋＋与4个Cys残基形成配位键CysCys糖皮质激素受体ZYJ272

3、调控蛋白与蛋白质结合的方式（1）HLH结构特点：长40～50个AA残基中含有两个既亲水有亲酯的α螺旋,被不同长度的连接区隔开(环)此类蛋白借助两个螺旋对应面上疏水基团的相互作用形成二聚体(同种或不同种亚基)鉴定的较清楚的蛋白质与蛋白质相互作用的结构基元有螺旋-环-螺旋（HLH）Leu拉链HLH基元附近有个高度碱性的区段为结合DAN所必须bHLH（2）Leu拉链蛋白上含有4或5个精确的相距7个AA的Leu残基概念：调控蛋白上富含亮氨酸残基的结构域参与形成二聚体Leu出现在α-螺旋疏水的一侧，并直线排列于是，两个蛋白分子的两个α－螺旋之间依赖Leu残基之间的疏水作用形成一条拉链Leu拉链区的氨基端约30个残基的碱性区与DNA结合Leu拉链作用形成Y型结构，拉链为茎、碱性区分叉对称成臂－－拉链蛋白的目标DNA为没有间隔的反向重复第二节乳糖操纵元一、乳糖操纵元1961Jacob&Monod（法国）1、结构:2、调节基因I产物为阻遏蛋白,四聚体为活性形式转录方式为组成型转录LacI的表达效率很低,原因—其启动子与RNApol的亲和性很低阻遏蛋白有两个结合位点:

操作子位点、

诱导物位点二、LacOperon的负调控1、细胞内无诱导物时,呈阻遏状态阻遏蛋白和操作子的结合,影响了RNApol在-10序列上形成开放型的启动子复合物2、细胞内有诱导物时,呈诱导状态诱导物与阻遏蛋白迅速结合而改变其构象→→→从O上解离→→→RNApol3、诱导物♫异乳糖(allolactose)乳糖进入细胞后，由β-半乳糖苷酶催化产生♫β-半乳糖苷酶来源于乳糖操纵元的本底组成型合成RNApol利用LacO处于游离状态的瞬间进行转录(阻遏蛋白与LacO有10min～20min的结合半衰期)一个mRNA／细胞周期♫安慰诱导物（义务诱导物）可诱导半乳糖苷酶产生但不是其底物*IPTG，异丙基-β-D硫代半乳糖苷*TMG，巯甲基半乳糖苷*ONPG，O-硝基半乳糖苷4、阻遏蛋白与操作子的相互作用（硝酸纤维素膜结合试验）

IPTGLacOCIR序列以+11为对称轴两边为两段各6bp的重复序列＋11+5到+17之间大部分在左侧－5＋21操作子的结构LacRepressor=tetramer三、LacOpreon的正调控－－CAP-cAMP复合物cAMPCAP蛋白cAMPLowglucose=highcAMP总结lacoperontranscription-controlregion正控制：CAPprotein负控制：repressor第三节TrpOperon及弱化作用机理一、结构

♫结构基因♫末端---终止子trpt’(依赖ρ)、trpt(不依赖ρ)邻氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油磷酸合成酶Trp合成酶♫相距很远的trpR编码阻遏蛋白其活性形式为四聚体,并且只有结合trp时才有活性♫控制区域:P、O和前导区及弱化子♫trpO与trpE之间的162bp的前导区可转录到mRNA中♫trpO的结构*位于trpP内，20bp,有完美的IR序列*trpP有正常的－35和－10区，－10区完全在trpO内二、阻遏调控机制无trp时有trp时无活性※弱化作用控制-----基因转录的翻译调控通过核糖体对前导区的翻译而对转录进行调控弱化子（attenuator):TrpOperon中trpE前的一段非结构基因的对应序列（123－150），其中包括不依赖ρ因子的终止子，由于翻译的作用使转录终止，这段序列称为…(衰减子)发现－－－缺失增加结构基因的表达，且与阻遏蛋白无关弱化子调控的表现：（与阻遏蛋白的负调控结果类似）*无trp时，所有RNApol都能通过弱化子*有trp时，部分逃过阻遏蛋白监督的RNApol在弱化子处大部分被扣留，而只有10％能通过1、TrpOperonmRNA的前导序列结构♦下游---14aa的前导肽的ORF，其中两个相连的trp的codonUGG(60位)对弱化作用的实现起重要作用♦下游长28bp的不依赖ρ因子的终止子为弱化子的核心部分♦前面有核糖体结合位点（S－D序列）2、前导序列的二级结构决定RNApol在弱化子处是终止转录还是继续转录1和2、3和4配对★序列1和2、3和4配对时，RNApol在3、4区的不依赖ρ因子的终止子处终止,其后的trpE等基因表达受到限制（翻译作用不存在时或顺利进行）2和3配对★序列2和3配对时，RNApol继续转录，使前导序列后的结构基因得以转录3、弱化子弱化控制的机制

Prok.无核膜，转录和翻译偶联（1）细胞缺少trp，Trp-tRNATrp水平低，核糖体停顿在两个邻近的Trp密码子处，此时核糖体占据序列1，此时序列4还没转录出来，序列2和3有机会配对，RNApol可通过弱化子(3)此外,Arg饥饿时有相同的后果(2)当细胞有Trp时,Trp-tRNATrp水平很高,核糖体顺利地翻译出前导肽而在终止密码子处(+70,UGA位于序列1和2之间)解离,此时,核糖体占据了序列1和部分序列2,使序列2不能有效地和序列3配对,因而序列3和4产生终止子发夹结构,转录终止☻实现弱化子对转录的调控关键是时间和空间上的巧妙安排空间上：两个Trp的codon位置至关重要时间上：核糖体停顿在两个Trpcodon上时，序列4还没转录出来，否则……这种巧妙安排的一个原因就是RNApol在转录完+90序列处时产生一次延宕给与核糖体以追赶的机会5、Prok.中弱化子（衰减子）的普遍性许多负责氨基酸合成的operon都受弱化子的控制，尤其是Hisoperon中，弱化子是唯一的调控机制第四节基因转录的时序调控时序调控:Prok.在生长发育的各个阶段，基因的表达是按照一定的时间顺序而展开的如:噬菌体的复制和颗粒的包装*有效利用能源避免浪费*避免了某些基因表达时机不当所带来的危害是多种蛋白质与RNApol作用的结果一、枯草杆菌中σ亚基的替换1、枯草杆菌中phageSPO1早、中、晚期基因表达的转换早期基因---寄主的RNApol全酶σ55早期基因28编码的gp28取代σ55含有gp28的全酶转录中期基因中期基因33、34编码的gp33、gp34取代gp28以gp33－gp34为σ亚基的全酶转录晚期基因2、枯草杆菌孢子形成过程中σ亚基的替换二、λphage裂解性生长和溶源状态的调控λphage进入寄主体内后环化其中—♦裂解周期--环形分子大部分基因表达♦溶源状态--以线性分子形式整合到寄主的染色体上,使大部分基因不表达λPhage的操纵元组织情况(一)λphage裂解生长过程中的基因表达进入寄主cell的λphage的DNA上没有任何调节蛋白，因此寄主的RNApol便结合于PL和PR1、抗终止蛋白PN和调节蛋白Cro首先被转录2、PN蛋白的作用导致PL和PR控制的迟早期基因的表达表达产物CⅢ蛋白、CⅡ蛋白、O蛋白、P蛋白、Q蛋白3、PQ蛋白的作用导致PR’控制的晚期基因的表达表达产物头尾蛋白、溶菌酶蛋白（二）溶源途径巧妙的调控，小区段表达，整合到寄主染色体上*此外，CⅡ促进Pint启动子转录，使intgene表达产生整合酶1、溶源化的建立－－PE启动子的转录*CⅢ、CⅡ蛋白共同确立PE处CⅠ的转录（左向）PE(EstablismentPromoter)*CⅠ阻遏与裂解生长有关基因的转录，其中转录出的CⅠmRNA含有S-D序列，因此有很高的翻译活性Pint启动子N蛋白和Cro蛋白被转录N蛋白抗终止CⅢ、CⅡ蛋白被转录CⅡ作用于PE(PRE)转录CⅠ左向转录阻遏蛋白结合于OROLCⅠ导致自身从PRM处转录♫CⅢ、CⅡ蛋白是CⅠ合成的正调控因子，作用于PE处，CⅡ是关键♫Cro蛋白间接抑制CⅢ、CⅡ的转录，直接阻止CⅠ的转录2、溶源化的维持—PM启动子的转录♫已产生的整合酶使λ整合并实现溶源化（attp、attB）♫溶源化的维持需要低水平的CⅠ转录，保持自身阻遏循环，这个功能由PM完成♫CⅠ蛋白对PM正调控，但PM起始转录的CⅠ没有S-D序列，因此翻译效率很低，但足以维持溶源状态♫溶源状态的维持通过CⅠ蛋白结合于OL、OR上而实现溶源周期3、CⅡ、CⅢ蛋白对CⅠ和Cro的影响CⅠ和Cro是λphage的两种调节蛋白，其中Cro能关闭CⅠ的表达溶源化状态的进入与否靠二者结合操作子的情况决定，数量是谁占上风的关键二者与操作子的亲和次序为CⅠ蛋白OL1›OL2›OL3OR1›OR2›OR3Cro蛋白OL3›OL2›OL1OR3›OR2›OR1OL1›OL2›OL3OR1›OR2›OR3结合的结果阻止PL和PR的转录CⅡ、CⅢ蛋白是CⅠ和Cro蛋白谁占上风的关键因为－－在CⅡ、CⅢ的帮助下CⅠ表达而Cro蛋白远早于CⅠ蛋白的表达OL1和OR1分别与PL和PR重叠即---CⅠ阻遏二启动子的能力强★正常情况下，寄主的hfl基因产物大量存在导致Cro占上风因为hfl编码一种蛋白酶水解CⅡ

♦此时Cro蛋白对左右两个早期操作子亲和力的差异，使两个操纵元初期表达一段时间才关闭

♦因此产生足够的O、P蛋白（复制有关）和PQ，从而使菌4、导致溶源化的因素（1）营养耗竭：寄主能源濒临枯竭时，导致cAMP产生等一系列生理变化

*cAMP对hfl基因负调控，使分解CⅡ蛋白的酶大大减少，CⅡ又能抑制该酶，因而CⅡ、CⅢ→CⅠ

体走向裂解（2）MOI值过高（≧10）：MOI指感染时λ噬菌体与细菌的比例，称感染复数

*CⅡ蛋白其作用的形式是寡聚体形式，单体不稳定无活性

*一两个噬菌体感染寄主时，产生的CⅡ不足以形成寡聚体

*MOI值过