不同加工条件下桑叶中-氨基丁酸的测定

不同加工条件下桑叶中-氨基丁酸的测定

氨基丙烯酸（氨基丙烯酸）是一种广泛存在于原核生物和真核生物的非物质氨基酸。在ph值（4.0310.56）下，它不仅具有正电和负电，而且具有负电。它对动物、大脑和骨髓也有很多影响。然而，由于gaba作为抑制神经血液循环和转化中枢神经系统的手段，它起到了很好的医疗药物和保健品的作用。γ-氨基丁酸的快速测定方法很多,但γ-氨基丁酸对电化学和紫外可见光不灵敏,用直接方法进行测定比较困难。目前测定GABA的方法有:放射受体法、薄层扫描法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法。放射受体法不够稳定,结果重复性较差;薄层扫描法易受环境因素影响;气相色谱-质谱联用法仪器昂贵,样品的衍生操作复杂,其应用范围受到一定的限制;高效液相色谱法有一定的优势,但其样品也要进行衍生操作。氨基酸分析仪虽可提供准确、高灵敏度的测定方法,但常规的生理体液分析方法耗时太长(130min),因此不利于大批量样品的快速分析以及临床监测。因此需要寻找一种简便、快速、低成本的测定方法。本实验,采用分光光度法测定γ-氨基丁酸的含量,主要依据是Berthelot反应。Berthelot反应是利用苯酚和次氯酸钠与游离氨反应,生成有色物质用来测定不同体系中微量氨及其盐类,具有极高的灵敏度。ω-氨基酸的反应灵敏,而α-氨基酸响应低,对于GABA和常规氨基酸来讲,它们在Berthelot反应中的响应差别悬殊,GABA有很高的响应。Tsushida在测定茶叶中谷氨酸脱羧酶活力时,采用比色法测定了酶反应体系中GABA含量。然而,植物叶片中含有大量的色素,会严重干扰比色反应,这些干扰物质很难去除。本实验对桑叶中水溶性色素的去除和GABA含量的测定方法及GABA热稳定性进行了研究,以期为桑叶的开发与利用提供技术和理论依据,为GABA的相关研究提供参考。1材料和方法1.1材料表面桑叶(5月):浙大华家池校区采摘。1.2试剂及仪器苯酚:分析纯,杭州双林化工试剂厂;γ-氨基丁酸:生化试剂,上海伯奥生物科技公司;无水乙醇:分析纯,上海申翔化学试剂有限公司;甲醇:分析纯,上海申翔化学试剂有限公司;无水三氯化铝:分析纯,上海新城精细化工有限公司;固体氢氧化钾:分析纯,上海申翔化学试剂有限公司;固体磷酸氢二钠:分析纯,成都东金化学试剂有限公司;固体磷酸二氢钠:分析纯,成都东金化学试剂有限公司;次氯酸钠溶液:分析纯,杭州高晶精细化工有限公司;纯净水:娃哈哈集团。1.3仪器、仪器和仪器TDL-60B飞鸽牌离心机:上海安亭科学仪器厂;SZ101-3型鼓风电热恒温干燥箱:浙江诸暨电热仪器厂;ZH-WY-110X恒温振荡器:北京瑞利仪器有限公司;UVmini-1240分光光度仪:岛津国际贸易(上海)有限公司;DK-8D型数显电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;玻璃仪器气流烘干器:上海豫康科教仪器设备有限公司;DELTA320pH计:梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;EL204-IC电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。2实验方法2.1桑叶去色素实验2.1.1研磨粉碎方法选择新鲜、基本完整的5~6张桑叶叶片,用蒸馏水将叶片冲洗干净,100℃烘干1~2h。干燥后的样品,经粉碎机粉碎或经研磨粉碎。称取2.5g样品加入装有10mL甲醇的离心管中,室温振荡10min,5000r/min离心15min,弃上清液,将沉淀全部转移至干净的滤纸上,待沉淀完全干燥后,将沉淀转移至100mL的烧杯内,加水25mL,放入恒温振荡器中,50℃恒温振荡提取2h后,5000r/min离心15min,取上清液定容至25mL,低温保存备用。2.1.2吸光度测定水溶性色素一般在260~350nm处具有较强的光吸收,样品用AlCl3提取后,可消除水溶性色素及杂质对测定的干扰,因为AlCl3可与水溶性色素结合形成不溶性络合物,经离心可去除掉。各取1.0mL样品提取液,设置12组,分别加入0、20、40、60、80、100、120、140、150、160、170、180μL2mol/L的AlCl3溶液,为保证体积相同再分别加入180、160、140、120、100、80、60、40、30、20、10、0μL蒸馏水,室温振荡15min,放置于高速冷冻离心机内12000r/min离心5min,各取0.5mL上清液,分别加入300μL1mol/LKOH溶液,室温振荡5min后,12000r/min离心5min,取上清液,340nm处测定吸光值。2.2标准曲线的构建为研究脱色处理对GABA含量的影响,特选用标准样品,进行脱色处理,同时选用标样不作脱色处理作为对照。2.2.1标准曲线的制作准确称取GABA标准样品0.025g,用蒸馏水溶解,定容至25mL,配制不同浓度的GABA标准溶液。分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的前面刚配置的GABA标液,并加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mL的蒸馏水,配成不同浓度的标准液,而后,分别加入150μL2mol/L的AlCl3溶液,混匀后室温振荡15min,高速冷冻离心机12000r/min离心5min,取上清液0.5mL于离心管中,加入300μL1mol/L的KOH溶液,室温振荡5min,12000r/min离心5min。然后,分别取上清液300μL入小试管中,加0.2mol/LpH10.0的磷酸盐缓冲液200μL,6%的重蒸酚100μL,混匀后再加入0.8mL5%的NaClO溶液,充分混匀。然后,迅速放入沸水浴中加热10min,立即置冰浴中5min,待溶液出现蓝绿色后,加入2.0mL60%酒精,于645nm波长处测定吸光值。以吸光值为纵坐标、GABA含量为横坐标,绘制GABA标准曲线。2.2.2吸光度测定分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的前面刚配置的GABA标液,并加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mL的蒸馏水,配成不同浓度的标准液,再分别取300μL入小试管中,加0.2mol/LpH10.0的磷酸盐缓冲液200μL、6%的重蒸酚100μL,混匀后再加入0.8mL5%的NaClO溶液,充分混匀。然后迅速放入沸水浴中加热10min,立即置冰浴中5min,待溶液出现蓝绿色后,加入2.0mL60%酒精,于645nm波长处测定吸光值。以吸光值为纵坐标、GABA含量为横坐标,绘制GABA标准曲线。2.3吸光度测定取2.1.1中配置的样品提取液1.0mL,脱色处理后,按照标准曲线配置进行操作,于645nm处测吸光值。测得的吸光度,依据标准曲线,即可求出提取液中GABA的含量。2.4溶液温度对产物浓度的影响采用分光光度法来测定温度、加热时间及pH对GABA稳定性的影响。取0.10gGABA标品定容至100mL,配成GABA标准溶液,按照脱色方法进行处理,用于稳定性的测定。取12个小试管,分别加入2mL上述GABA标液,塞好试管塞,确保液体不会有渗漏现象产生。将试管外壁擦干后,称其总质量,并作好记录。本实验共计实验组9组、对照组2组,具体处理如下:(1)调节样品溶液pH到4.5,分别在85、93、100℃3种不同温度下加热20min,以测量加热温度对γ-氨基丁酸含量的影响;(2)调节样品溶液pH到4.5,分别在93℃温度下加热5、15、25min,以测量加热温度对γ-氨基丁酸含量的影响;(3)将样品溶液pH分别调至4、5、6,在93℃温度下加热15min,以测量pH对γ-氨基丁酸含量的影响。3结果与讨论3.1脱除提取液中对色素的干扰如图1所示,经AlCl3处理后,样品中的吸光度明显下降,表明AlCl3能显著降低提取液的光吸收值,有效地去除了提取液中水溶性色素。实验表明,桑叶样品未经脱色处理,其中的色素会干扰比色反应,故应去除。根据实验数据得出,1mL的样品提取液加入150μL的AlCl3溶液,即可有效去除色素。3.2重复测定根据比色法测定数据,绘制标准曲线,得到回归方程式为:Y=0.188X+0.0413,R2=0.9973,如图2所示。重复测定3次,结果相接近。由图2可以看出,经过脱色处理的样品稳定性很好,脱色处理对GABA含量的影响比较小。3.3干扰物质测定根据比色法测定数据,绘制标准曲线,得到回归方程式为:Y=0.3184X+0.0264,R2=0.9736,如图3所示。重复测定3次,结果相接近。由图3可以看出,标准样品中有少量干扰物质,影响GABA的含量测定。因此应采用脱色方法处理样品,进行桑叶中GABA含量的测定。3.4gaba含量的确定将配置的样品提取液按上述脱色方法进行GABA含量测定。测定得吸光度ABS=0.0833,桑叶中GABA的含量按下式计算:GABA质量比(mg/g)=C×V/m式中:C为由直线方程计算的值,mg/mL;根据公式,计算得出桑叶中含有2.247mg/g的GABA,即100g桑叶中约含有224.7mg的GA-BA。3.5不同温度对gaba稳定性的影响由图4我们可以看出,温度较高对GABA的损耗较大。85℃和93℃分别处理20min后,GABA损耗量大致相同,分别是下降了24.5%和27.5%;而100℃温度下处理20min,GABA相对93℃温度情况下又减少了一部分,并且减少量相对较大,高达59.2%。根据实验结果,我们认为,在85~100℃之间应该有一个温度点,超过这个温度点后,GABA的稳定性逐步变差,而处于85~93℃温度下,GABA的稳定性相对较好。因此,在实际生产加工过程中,可以将温度设定在85~93℃之间,以减少温度造成的GABA含量的损失,尽可能地提高原料中GABA的利用率。3.6加热时间对gaba稳定性的影响由图5可以看出,加热处理的时间对GABA含量会产生一定影响。加热5min,GABA含量即有一定的下降,为23.6%;继续加热到15min,GABA含量的变化下降到26.5%;到25min时,GABA含量再有一定的下降,为35.0%。说明加热时间在15min,GABA的稳定性较好,而多于15min以后,会对样品中GABA产生较大的损耗。在实际生产过程中应尽量将加热时间控制在15min以内,以保持GABA的稳定性。3.7ph对gaba含量的影响由图6可以看出,不同pH条件下,GABA的稳定性有较大的变化,pH对GABA含量的影响逐渐变大,当pH为4和5时,GABA含量分别下降25.5%和41.8%,当pH为6时,GABA含量有较为显著的下降,为53.1%。因此在生产过程中,应尽量避免这一pH范围,使样品中GABA有良好的稳定性。4加热时间和加热温度对样品稳定性的影响实验中通过AlCl3溶液去除了桑叶中水溶性色素的干扰,去色效果较好,得出的实验结果较为理想:1mL的样品提取液加入150μL2mol/L的AlCl3溶液,即可有效去除色素。γ-氨基丁酸稳定性的研究中,当加热时间为20min、