外源基因在转基因食品中的安全性评价

外源基因在转基因食品中的安全性评价

1983年，美国成功种植了第一个转世植物，标志着转世技术的正式诞生。在随后的20多年里,转基因技术获得了迅猛发展,2007年全球种植转基因作物(GMP)的面积已达11430万hm2,其中我国GMP(Bt抗虫棉)的种植面积约380万hm2。随着转基因作物商品化应用的增多,转基因食品越来越多。通过基因工程将一种或几种外源性基因转移至某种特定生物体中,并使其有效地表达出相应的产物(多肽或蛋白质),这样的生物体直接作为食品或以其为原料加工生产的食品叫做转基因食品[2~4]。转基因食品与传统食品的主要差异在于前者含有来源于其他生物体的外源基因。由于目前的科学技术水平还不可能准确地预测一个外源基因在新的生物体中会产生什么样的作用,因而含有外源基因的转基因食品的安全性问题受到社会的普遍关注。为此,论述了转基因食品安全性评价的内容和方法以及转基因食品的检测方法。1非典型食品的安全评估1.1其他方面的毒性作用任何DNA都由4种碱基组合而成,目前所用的标记基因在DNA组成上并无异常。转基因食品中外源基因的含量很少,通过食用转基因食品而摄入体内的外源基因的数量与消化道中持续存在的来源于其他食品中的DNA数量相比是微不足道的,WHO与FDA认为转基因食品中的外源基因本身不会对人体产生直接毒害作用。1.2dna的降解转基因食品中的外源基因被摄入人体是否会存在安全性问题,目前的结论是这种可能性很小。理由为:①DNA从植物细胞中释放出来后,很快被降解成小片段,甚至核苷酸,因此植物DNA在进入有肠道微生物存在的小肠下段、盲肠和结肠前已被降解;②即使有完整的DNA存在,DNA转移整合进受体细胞并进行表达也是一个非常复杂的过程。目前尚未发现消化系统中有植物DNA转移至肠道微生物的现象。同时,上皮细胞又因其半衰期很短而不断被取代,不可能被保存下来。因此被摄入人体内的转基因食品中的标记基因水平转移并表达的可能性极小。1.3直接毒性评判方法毒性的评价对于用任何一种原料及方式生产出来的食品第一次食用前都是必需的,包括天然食品。对外源基因编码蛋白的直接毒性进行评判主要根据以下方面进行:①根据外源基因编码蛋白的化学组成判断其毒性;②采用动物试验或模拟试验的方法评判外源基因编码蛋白的毒性。目前通过严格审查后被批准的外源基因编码蛋白对人类均无直接毒性。1.4第二,过敏蛋白质的氧化对产品的安全性评价植物成分中含有上万种不同蛋白质,虽然其中仅有极少数蛋白质具有过敏性,但仍然不排除出现新的过敏性食品的可能。因此在对转基因食品进行安全性评价时,过敏诱发性是相当重要的因素。转基因食品中所引入的蛋白质,有可能引起食品过敏,特别是儿童和具有过敏体质的成人,这是最重要的问题。从免疫学角度分析,已知致敏蛋白质的氨基酸序列与转入的蛋白质有明显的同源性。转入的蛋白质属某类蛋白的成员,而该类蛋白质家族中的有些成员是致敏蛋白质。若转基因食品中含有对一部分人群有过敏性反应的蛋白,则需加标签方便购买者选择。1.5标记基因对肠道微生物的影响目前,抗生素抗性基因已成为转基因食品中常用的标记基因。在某些情况下抗药性标记基因有可能传递给人畜肠道微生物,从而影响到口服抗生素的药效。标记基因也有可能传递给肠道正常微生物群,通过菌群影响人肠道的微生态环境及消化道的正常消化功能。但是随着科学技术的发展,现在已可将转基因植物中的标记基因通过定位重组技术删除,或者可用更安全的标记基因,也可不用标记基因。1.6外源基因的插入目前转基因技术的手段还是不完善的,无法准确控制外源基因在宿主染色体中的插入位点,不可能达到定向插入的程度。外源基因的插入会对宿主体内某些基因的表达产生影响,可能会造成多效性。最常见的有两种情况:①外源基因的插入引起宿主体内某一基因失活;②外源基因的插入使原来沉默的基因激活。这也是目前转基因植物仍需进行安全性研讨的主要原因之一。2食品安全性分析转基因食品不同于食品添加剂、农药残留、兽药残留或化学污染物等外来化学物,故传统的食品安全评价标准和方法不适合于评价转基因食品。转基因植物或源于它的食品可能发生了非预期效应,这些效应有可能是对健康不利的、中性的或有益的。1993年,经济合作发展组织(OECD)第一次提出了食品安全性分析的原则——“实质等同性”原则。即如果某个新食品或食品成分与传统的食品成分大体相同,则在安全性方面可将其以相同的方式对待,可以得出食品或食品成分与常规食品或食品成分一样安全的结论。根据“实质等同性”原则,转基因食品的评价方法具体可分为以下几类。2.1实体法上的安全性评价遵循“实质等同性”原则,将转基因植物与传统植物进行形态学和生理学的比较,实质等同性概念是安全性评价过程中的关键步骤。但实质等同本身并不是安全性评价,而是构建新食品相对于其传统对应物的安全性评价这一框架的起点。通过这种方式进行安全性评价并不意味着新产品绝对安全,它更注重针对于任何确定的差异方面的安全性进行评价,因此新食品相对于传统对应物的安全性就可得到考虑。2.2等同性和相似性的结合方法欧洲国际生命科学学会于1996年提出的用于转基因食品安全性评价的基本指导原则。2.3faga改革法该方法是Fagan提出的,比“实质等同性”原则下的动态比较法更为严谨科学。2.4转基因食品的安全性评价该方法是1998年国际食物生物技术委员会和国际生命科学学会提出来的,通常用于转基因食品潜在过敏性评价,进一步完善了转基因食品的安全性评价方法。世界卫生组织曾指出,选择标记基因的安全性应与目标基因等其他基因一样进行全面评价,包括选择标记基因的分子、化学和生物学特性,以及选择标记基因编码蛋白的安全性,如直接毒性、蛋白的过敏性及蛋白功能的安全性等方面。3检测移动食品的方法目前转基因食品的检测方法主要有两类,一类是针对转基因食品中重组DNA的表达产物蛋白质,另一类是直接针对转基因食品中的重组DNA。3.1通过转移食品中的dna分离，澄清产物蛋白质3.1.1抗体与出现物的反应ELISA检测是将抗原与抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用结合起来,根据酶作用于底物后的显色反应,当抗原与抗体结合时,借助于比色或荧光反应鉴定转基因成分,酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量呈正比。这是目前比较常用的两种检测转基因食品方法之一。3.1.2蛋白质印花法韦尼赫赫3.1.3流型免疫计定lateral血流3.2转移食品中的遗传因子3.2.1定性检测3.2.1.pcr扩增dna该法是模拟体内DNA复制方式在体外选择性扩增DNA某一个特殊区段的技术,需要DNA模板、引物、原料(dNTP)、酶(DNA聚合酶)等材料,通过变性—退火一延伸3个反应的循环,只需极微量的DNA模板即可扩增出大量的目的基因片段,具有快速、简便、灵敏等特点。这是目前比较常用的两种检测转基因食品方法之一。3.2.1.多种基因元件同时检测多重PCR技术可以在同一反应试管中同时针对多个靶位点进行PCR检测。目前,不仅有关于多重PCR同时成功检测转基因食品中多种基因元件的报道,而且也有文献报道多重PCR与实时荧光定量PCR相结合可对多种基因元件同时进行检测。如Carcia-Canas等应用多重PCR法同时成功检测了5种转基因玉米。多重PCR法较常规PCR技术更为简便、快速和准确,有很好的应用前景。3.2.1.次pcr检测巢式PCR(nestedPCR)原理是设计2对引物,其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上,通过二次PCR反应对某个基因进行检测。通常第一次采用能扩增较大片段的引物,经过20~30次循环扩增后,将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。半巢式PCR(semi-nestedPCR)的原理与巢式PCR基本相同,只是半巢式PCR只有一对半引物,有一个引物被用于二次PCR反应中。3.2.1.基因的组织排列通过对特异性探针结合的基因组DNA片断内或其周围序列进行限制性内切核酸酶酶切位点作图来研究基因在基因组内部是如何组织排列的。在转基因食品中用Southern技术,是在知道该转基因食品转入外源基因片段的情况下使用的。该技术可检测出食品外源基因与内源基因有高度同源性的DNA片断,且准确可靠,但对样品的纯度要求较高。3.2.1.化学发光法电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)是指通过电化学方法产生一些特殊的物质,然后这些电生物质之间或电生物质与其他物质之间进一步反应产生的一种发光现象。它是化学发光与电化学方法相互结合的产物。电化学发光PCR法首次将电化学发光技术、PCR技术和双探针杂交技术结合起来,用于检测CaMV35S启动子,从而判断其是否含有转基因成分。3.2.2定量检测3.2.2.竞争dna的分子通过比较要扩增的样品中目标DNA和在同一体系中进行扩增的已知量的竞争性DNA而得到的,竞争性DNA必须与目标DNA具有相同的引物和不同的分子量,以便两者既能同时进行扩增反应又能使扩增后的两种产物通过凝胶电泳区分开来。3.2.2.马铃薯、玉米、生长番茄的样品测定该法是多重PCR和实时荧光定量PCR的结合。刘光明等利用该技术对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄共11份实物样品进行检测,结果显示2份马铃薯样品及大豆、玉米、甜椒各1份样品中检出35S和Nos双组分,另6份样品均未检出。3.2.2.实时荧光定量监测实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。陈颖等利用该方法对转基因玉米和大豆进行检测,灵敏度小于0.01%,是国际上设定的转基因最低限量的100倍。3.2.2.其他传统食品的检测方法这是一种将PCR的高效性与ELISA高特异性结合在一起的检测方法,它利用地高辛或生物素等标记引物,将PCR扩增产物与固相板上特异的探针结合,再加入抗地高辛或生物素的酶标抗体——辣根过氧化物酶结合物,最后使底物显色,在酶标仪上读取数值。该方法快速方便,避免了有毒物质EB的使用,适合大批量自动检测。总之,转基因食品一要像对比的传统食品那样安全,二要营养价值不低于对比的传统食品。随着分子生物学和毒理学方法的发展,将来可以用更新的手段去重新评价和检测转基因食品的安全性,并制定相应的卫生标准。Western印迹法的原理是抗原抗体的特异性结合,主要步骤是将从待测样品中提取的分子大小不同的蛋白质(抗原)混合物用凝胶电泳的方法分离后,将其转移到固体支持物上,用标记的抗体作探针与之杂交,通过放射