极端酶的研究进展

极端酶的研究进展

酶是生物催化剂。它的应用和研究经历了很长的历史。人们对某些酶的研究也达到了一定的水平，在生产实践中发挥了重要作用。然而，到目前为止，研究和应用于生产的大多数酶都来自普通生物。它们有许多优点，如高生命力和易制性，但在极温度、ph值、离子强度等环境中的不稳定性和生命力下降，对其使用限制。端酶来自端生物。这是端生物在极恶劣环境中生存和繁殖的基础。由于长期自然进化的结果，端酶可以在不能生存于普通生物的环境中保持活力和稳定性。此外，一些极端微生物，如老细胞菌，具有极其独特的代谢方式，并且对其生产的极端酶具有很高的理论价值。1极端环境下微生物的基因组织特点.我国第20e现在人们知道,在那些绝大多数微生物所不能生长的极端恶劣的环境中栖息着某些种类的微生物,这些微生物叫做“极端微生物”.极端微生物的种类,生存环境和例举见表1.大部分极端微生物通过16sRNA序列的比较都鉴定为古细菌,也有部分极端微生物属于最原始的细菌种类,它们在进化树上的位置可能位于根部.一般来说,生物合成的酶与这种生物的生长环境相适应.所以,在越极端的环境中分离的微生物越有可能产生极端酶.传统的微生物发酵的技术路线,是先获得微生物的纯培养,然后通过生化手段或克隆表达相应的酶基因来获得酶,依靠这种方法已经获得了一些极端酶.当无法得到微生物的纯培养时,则必须采用其他的方法,如在环境DNA表达文库中筛选所需基因或者通过克隆经PCR扩增的基因片段来产生可在普通宿主菌中表达的杂合基因等.到目前为止,对于普通的环境微生物,可能只有0.1%～1%的种类得到纯培养,极端微生物则更少.而且,极端环境下生物的多样性远远大于人们的想象.由于大部分的极端微生物还没有得到纯培养和被研究,因此,确定其极端酶的生化性质、结构特征、催化机理等等都很困难.随着分子微生物学的发展,微生物的基因组序列已经知道了37个,其中包括8株古细菌和一些极端嗜热菌.通过对这些基因组序列进行分析,以及和其他已知功能的生物蛋白质的序列进行比较,人们已经了解了它们基因组大约一半的开放阅读框.由于基因组数据包括每种生物体酶的所有信息,所以,根据这些信息,加上对表达蛋白的分析和验证,人们在极端酶的研究上已经取得了一些新的进展.2端基因实验对不同生物同工酶的同工酶活性的影响极端酶之所以在极端环境下有着与普通酶不同的活力和稳定性,其根本原因是它们在三维结构上的特殊性.通过对比常温生物和极端生物中同工酶的三维结构,人们已经初步阐明了一些极端酶的作用机制.2.1嗜热微生物的酶嗜热酶和超嗜热酶相对来说是人们最了解其三维结构的两类酶,高温谷氨酸脱氢酶和柠檬酸合成酶的结构的研究表明了离子相互作用在嗜热酶中的重要性.在这两种酶系中,嗜热酶在离子偶联的数量和程度上都胜过嗜温酶,而且柠檬酸合成酶嗜热酶还包括亚单位的相互作用和羧基端氨基酸残基的作用.但是,高温稳定性和离子相互作用的正比关系并不是普遍存在的.和嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus相比,从嗜热细菌Thermotogamaritima中分离的谷氨酸脱氢酶则有较少的离子偶联和较强的疏水相互作用.这可能由于细菌和古细菌在耐热机制上的差异造成的.至今还没有一个普遍的机理可以解释蛋白质的耐热性,而且,目前大部分的研究都是定性的,有关嗜热酶稳定性结构因素的定量研究还很少.相对于嗜热微生物的酶,从嗜冷微生物中分离的极端酶具有低温活性并且在常温下失活.有人推测嗜冷酶能在低温下保持活是由于具有比常温同工酶更柔软的结构.对具有低温活性的柠檬酸合成酶结构分析表明其活性部位的柔韧性来自于酶扩展的表面电荷环和酶表面上脯氨酸残基的减少;嗜冷菌FibrobactersuccinogenesS85分泌的低温葡聚糖酶催化亚基上较小的氨基酸则可以增加酶的柔韧性,而且其活性与溶液的离子强度有关.尽管嗜冷酶全部的催化机理还不是很清楚,但是毫无疑问,较柔韧的活性中心可以更容易地进入底物,从而可以更好的进行酶反应.而对嗜热菌Thermusthermophilus和大肠杆菌的3-异丙基苹果酸脱氢酶结构上的比较也证实了酶的催化功能和结构柔韧性的密切关系.另外,嗜冷酶也必须进行结构调整以避免蛋白质的低温变性,通常是通过减少低温下的疏水相互作用.P.furiosus的低温柠檬酸合成酶比嗜热柠檬酸合成酶包含有较多的离子偶联,推测这可以用来防止低温诱导蛋白质的解折叠.2.2知识产权酶的结构和功能从嗜盐生物中分离的极端酶可以在很高的离子强度下保持稳定性和活性,这对于极端嗜盐菌菌体的生长是极为重要的.氨基酸序列的分析比较表明嗜盐酶蛋白质比它们的普通同工酶含的酸性氨基酸更多.X射线晶体和同源性模拟分析揭示的三维结构表明这些酶的表面有大量带负电荷的氨基酸.这种带负电荷的酶蛋白表面可以结合大量水合离子,形成一个水合层,减少它们表面的疏水性,从而减少在高浓度盐度下的聚合的趋势.如生长在98℃的嗜热菌Methanopyruskandleri的甲酰转移酶也有高盐耐受性,三维结构的分析显示它有一个疏水的和高度酸性的表面.Jolley等对嗜盐古细菌Haloferaxvolcanii的丙酮酸脱氢酶复合体的结构做了初步研究.2.3极低ph值突变酶尽管极端嗜碱和嗜酸微生物菌体内部的pH值接近中性,但是他们的胞外酶必须在极高或极低的pH值环境中保持稳定和活力.也正因为这些酶很强的稳定性,它们是最早被发现的极端酶类.但是,目前还未见有关它们结构的研究报道,所以,人们还不了解它们在极端pH值下稳定的机理.3定向突变筛选如果我们能够较为清楚地了解极端酶稳定性和活力结构基础,就可以通过定向诱变来改变常温酶的稳定性.如前面所提到的‘离子相互作用和热稳定性有关’的理论已经用于定向诱变的实验并获得成功:鸽子肝脏的苹果酸酶基因经过定向诱变产生了一个附加有谷氨酸和赖氨酸的重组突变体,形成了离子偶联.这使得酶的熔融温度提高了10℃并且改善了酶对脲的稳定性.在极端酶稳定性的结构机理还不是完全清楚的情况下,我们可以通过比较不同稳定性同工酶的氨基酸顺序来设计突变.VandenBurg等对从杆菌B.stearothermophilus得到的蛋白酶实施了8重突变,使甘氨酸替换成丙氨酸,丙氨酸替换成脯氨酸,引入了二硫键,减少蛋白质解折叠状态的墒,结果使野生型的蛋白酶在100℃下的稳定性提高340倍,并且有170分钟的半衰期和在100℃下降解蛋白酶抑制剂的能力.定向突变是一种包括随机突变、基因重组和目的特性筛选等一系列步骤的方法.Kuchner等报道了经过改善了热稳定性的p-对硝基苯甲酰基酯酶.易错聚合酶链式反应进行5个循环的连续突变后,在催化活性和热稳定性上进行选择,筛选到了一个熔融温度比野生型酶高14℃的酶.相同的方法已经用于从常温细菌Bacillusamyloliquifacieus中分离到的碱性蛋白酶,而且得到了一个在较高温度下有较好稳定性的蛋白酶.而相互关联的基因片段的随机重组(即DNA重组)则形成了新的基因,改变微生物的代谢途径并且为酶的定向突变提供了选择.对大肠杆菌砷抗性操纵子的突变筛选,产生了对培养基中的砷酸盐抗性提高40倍的酶,这其中包括有13个砷抗性操纵子突变和10个亚砷酸盐膜泵突变.Giver等还讨论了直接进化脂酶的热稳定性和活性之间的关系.通过对已经建立的DNA样品表达文库进行筛选来发现对特殊生物转化过程具有合适的特异性和稳定性的酶也是一个途径.对嗜热微生物表达文库的筛选发现了产生有极强热稳定性和活力的胞外淀粉酶的重组体,其最适作用温度为100℃,在98℃有13h的半衰期,这比从Bacilluslicheniformis中得到的商业用酶的性质有了很大改善.Dong等筛选到了一个支链淀粉酶的克隆,其酶最适作用温度为105℃,对化学变性剂有很高的抗性,而且在表面活性剂存在时活力增加两倍.4嗜热微生物基因在大肠杆菌中的表达极端酶的应用需要微生物的大规模培养和酶的发酵生产.如果酶是直接从野生菌株直接合成得到,则会因为极端微生物的培养条件要求极端温度、厌氧环境、极端pH值或者高盐度等原因而无法进行通常的工业发酵.所以,极端酶的生物合成还得依靠在常温微生物菌体内相应基因的表达,这样就避免了培养极端微生物的问题.但是在表达时如果被表达的酶需要宿主本来并不利用的辅助因子或金属离子,就会遇到一些困难.现在一般认为极端嗜热微生物的基因可以在象E.coli这样的常温微生物内表达.Hess等在大肠杆菌中表达了嗜热微生物Thermotoganeapolitana5068的木糖异构酶,表达产物和原始蛋白质在组装上有轻微的差别,但这并不影响酶的稳定性和催化特性.Buchanan等在大肠杆菌中表达了嗜热古细菌Sulfolobussolfataricus的极端嗜热醛缩酶,其表达产物在酶的动力学上和原始酶一致.嗜冷菌编码具有低温活性酶的基因也已经成功的表达,在0～2℃范围内产α-淀粉酶的嗜冷菌Alteromonashaloplanktis的酶基因已经在大肠杆菌中表达,发现大肠杆菌必须在低于室温(最适温度为18℃)的条件下培养,才可使酶正确的折叠,避免酶的不可逆变性.类似的情况也出现在低温蛋白酶和低温脂酶的表达中.Coombs等把编码低温β-半乳糖苷酶的基因在大肠杆菌中表达,其表达产物极易失活,必须在10%的甘油中才可保持稳定.极端嗜盐酶在普通宿主内的表达比较复杂一些.极端嗜盐菌Haloferaxvolcanii的细胞可以蓄积KCl到浓度为5M,在高盐环境中合成的极端嗜盐酶折叠成有活性的自然构象.低离子环境中嗜盐微生物基因在大肠杆菌内的异源表达可以导致嗜盐酶的失活.Cendrin等将嗜盐古细菌Haloarculamarismortui的苹果酸脱氢酶基因在大肠杆菌中异源表达时,产生可溶的、无活性的产物.在变性剂如盐酸胍或脲的存在的情况下表达产物经过解折叠或增溶,再通过复性,一般可以得到和天然酶相类似的结构.对于极端嗜碱酶和嗜酸酶的表达,文献报道的较少.Kulakavo等在大肠杆菌中表达了嗜冷菌的碱性低温蛋白酶的基因,表达产物的最适pH值为9.0.5端酶的潜在价