基因敲除技术的研究进展

基因敲除技术的研究进展

2003年4月14日，美国国家人类基因组织（nationalacademyofadministration）负责人在巴黎宣布，国际人类组织的计划将比最初的计划早两年。通过实施人类基因组计划,得到了人类几乎全部基因的核苷酸序列,但对于大多数基因的功能却知之甚少。基因敲除(Geneknockout)是借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,藉以揭示基因功能最直接的手段之一,因此成为后基因组时代的重要研究方法和内容。1细胞免疫药物创造的基因敲除胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ESC)是早期胚胎细胞经体外抑制分化培养建立的多能性细胞系,体外培养时保持了未分化状态,可以传代增殖,在发育上类似于动物早期胚胎的内细胞团细胞,具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点,是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。ESC是进行基因敲除研究不可替代的材料。目前,虽然体外培养乳腺细胞、胎儿成纤维细胞等细胞类型的技术都已相当成熟,对这些类型的细胞进行基因组修饰也是完全可能的,但ESC的另一特性是其它任何类型的细胞都不具备的,那就是当将一定数目的ESC注入囊胚期小鼠的囊胚腔后这些细胞可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成,在此基础上,通过检测和选配,筛选出基因组中正常基因被破坏的动物个体,通过行为观察、生理生化指标检测等手段可以揭示该基因的作用。迄今为止,只有小鼠干细胞的建系方法最成熟、效果最稳定,因此小鼠是基因敲除研究的唯一的实验动物模型。2基因分离的建立和源重组干预的筛选2.1gnas基因外显子片段构建特定基因的敲除载体必须深入了解该基因的结构组成,如组成该基因的核苷酸序列、外显子和内含子数目、特定位点的限制性内切酶的种类以及该基因在染色体上的定位等。William等希望研究腺苷酸环化酶刺激性G蛋白(Gnas)基因突变的可能结果,该基因有13个外显子,被定位在人类染色体的20q13.1-13.2。用包含小鼠Gnas基因外显子1部分序列的片段为探针,从文库中筛选出包含Gnas其它外显子的克隆,从中获得了一个长为6.0kb、两端为BamHI酶切位点的片段,该片段包含翻译起始位点AUG上游2.0kb到第2外显子中部的核苷酸序列。将该片段克隆到pBluescriptII上,并以之为基础构建敲除载体。用NcoI和Nrul双酶切上述片段,将位于AUG附近和第1外显子之间500bp的片段切除,并插入作为筛选重要标记的新霉素抗性基因(neoR),从而构建了用于实现Gnas基因敲除的载体。2.2源重组中干预的筛选筛选发生了同源重组的干细胞的方法主要有以下三种。2.2.1区域间联合机构的联合杂交结果该方法的原理很简单,即用特定的限制性内切酶消化从经过扩增的干细胞中提取的基因组DNA,用敲除载体为探针,对于发生了同源重组的干细胞克隆和随机整合了敲除载体的干细胞克隆,其Southern杂交结果不同,杂交出的条带有差异。William等用pvuII消化来自每一干细胞克隆的DNA,然后与经标记的敲除载体杂交,对于随机整合的克隆可以杂交出一条大小为2.0kb的条带,而发生了同源重组的克隆则杂交出了2.0kb和2.4kb的两条带。2.2.2同源重组和随机插入采用在经过改造的载体中插入一小段寡聚核苷酸(约29bp)序列,该序列正好与基因组基因上的一小段序列组成一对PCR引物,这样通过PCR扩增产物的大小即可区分同源重组和随机插入。2.2.3u3000扩增载体的选择该方法筛选同源重组克隆的依据是对于线性化的外源基因片段无论采用电转化还是显微注射,外源基因整合进宿主基因组时的方式多为两头插入,根据这一现象Mario设计了长度大于10kb的载体,其中包含neoR基因,而在距离发生同源重组较远的位置上有一个由单纯疱疹病毒基因启动子驱动的胸苷激酶基因(HSV-tk)片段。先用G418筛选整合了经过改造的载体的克隆,这是正选择。接下来,对于随机整合的克隆其tk基因能得到表达,可检测到相应的表达产物。而发生了同源重组的克隆其HSV-tk基因经过反复传代势必丢失,也就不可能有表达,从而检测不到tk基因表达的产物,即负选择。2.3同源重组的概率目前报道的影响同源重组效率的因素主要是外源基因转染的方式。据报道,采用显微注射的方法,在经G418筛选出的克隆中,发生同源重组的概率为1/150,而采用电转化的方法时,经G418筛选出的克隆中,发生同源重组的概率仅为1/300。基因敲除的技术路线见图1。3精细管、保肝、阴栓的变化Eddy等将雄性小鼠的雌激素受体基因敲除,以研究雌激素受体基因对公畜繁殖性能的影响。结果表明,雌激素受体基因被敲除的雄性小鼠(ERKO)在解剖学上是正常的,但这样的雄性小鼠不育。成年ERKO公鼠附睾中的精子远少于正常公鼠,3~5月龄时部分ERKO公鼠精细管中有精子生成,但多数ERKO公鼠的精细管膨胀为空腔,腔内有一些组织紊乱的上皮细胞。10月龄ERKO公鼠的精细管与野生型公鼠的精细管无明显区别,附睾尾精子生成以及存活的数量也与野生型公鼠接近。10月龄以后,ERKO公鼠精囊腺、凝集腺、前列腺以及附睾在形态学上是正常的,但精细管内精子的发生出现紊乱和退化。血清中T含量有所升高,但LH和FSH水平与野生型公鼠无明显差别。这样的公鼠与经雌激素处理过的母鼠混养过夜,能见到阴栓的个体极少。ERKO公鼠由于雌激素受体基因缺失出现了交配频率降低、精子数量减少、精子发生紊乱等现象。Hu等将小鼠的卡巴B蛋白抑制因子的激酶1(IKK1)基因敲除以研究该基因的功能,结果表明,IKK+/-1+/−1个体的表型是正常的,但IKK-/-1−/−1个体出现了四肢突兀、头小于正常小鼠、无外耳、表皮无皱褶等异常现象。IKK-/-1−/−1个体能够发育到出生,但出生后30min内死亡,出生时IKK-/-1−/−1个体较正常个体小,心脏、肺、肝脏、脾脏、脊椎、头颅均异常。4isk2/2基因表达的缺失Li等将小鼠ESC中的卡巴B蛋白抑制因子的激酶2基因敲除,获得了杂合的IKK2突变体(IKK+/-2+/−2),杂合体在各个方面都是正常的,通过杂合个体之间的交配,研究者在很长时间内未能得到该位点纯合的个体,即IKK-/-2−/−2个体。在杂合状态时IKK2的表达只是受到了影响,但依旧有表达,而一旦纯合就意味着该基因的表达完全被中断,或者说即便有表达,表达出的蛋白质也不再是正常的IKK2。随后的研究表明,IKK-/-2−/−2属致死基因型,该位点纯合的个体在胚胎发育的早期(12.5~13.5d)死亡。原因是当无IKK2表达时,胎儿产生肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)引起早期胎儿的肝细胞发生大量凋亡,而在正常情况下,IKK2可抑制TNF-α引起的肝细胞凋亡。那么能否拯救这样的纯合子个体呢?通过IKK+/-2+/−2与TNF-α基因被敲除的杂合子小鼠交配,获得了IKK+/-2/TNF-α+/-的个体,通过这种基因型的公母鼠的交配获得了IKK-/-2和TNF-α-/-的个体。观察表明,IKK-/-2/TNF-α-/-的个体可以存活到出生,但出生后一月内死亡。5基因敲除的pcr扩增研究戴旭明等将线性化的针对小鼠凝血因子IX基因的敲除载体用电穿孔法转入小鼠ES细胞,经G418筛选,用PCR和Southern杂交的方法从具药物抗性的细胞中筛选出4个凝血因子IX基因被定向敲除的ES细胞克隆,为进一步开展基因敲除研究打下基础。陈广文等采用PCR扩增的方法研究了从美国德克萨斯大学引进的热休克因子1(Heatshockfactor1,HSF1)基因敲除小鼠的基因型。结果表明,采用PCR扩增的方法,野生型小鼠仅在562bp的位置出现一条带,突变纯合子则在377bp处出现一条带,而突变杂合子则在562bp和377bp处出现两条带。李雪岭等构建了可用于大鼠次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因敲除的载体。王冬平等采用解剖学和血清学指标测定的方法研究了Smad3基因敲除对小鼠肾功能的影响,结果表明,该基因敲除的纯合小鼠12.5%的个体表现为单肾,表明Smad3基