血根碱对体外培养的人类宫颈癌hela和siha细胞的影响

血根碱对体外培养的人类宫颈癌hela和siha细胞的影响

宫颈发病率在中国女性生殖器官肿瘤中最高。因此，选择抗宫颈药物具有重要的开发价值。在中药中筛选有效且毒副作用小的抗肿瘤药物已成为中草药研究领域的热点之一。血根碱(sanguinarine,SAN)的化学名称为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,分子量为367.8,它来源于罂粟科植物博落回的果实。早期的研究发现,它具有抗炎、抗菌、抗氧化作用,并对中枢神经有麻醉作用。近年来的研究发现,它还具有非常好的抗肿瘤功效,目前国内还未见任何SAN抗肿瘤研究的报道,即使在国外也主要集中在体外抗乳腺癌、前列腺癌等少数几种肿瘤的研究。2002年Ding等曾研究过SAN对抗药性宫颈癌细胞的影响。我们利用两种不同的人类宫颈癌细胞株研究了血根碱的抗肿瘤生长和转移作用。现报道如下。1材料和方法1.1细胞、培养基和血清本实验中我们选择了HeLa细胞作为宫颈腺癌的代表,Siha细胞作为宫颈鳞癌的代表。这两株细胞均购于美国ATCC公司。SAN(>99.0%)、胰酶、活细胞代谢物还原剂噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DM-SO)购于美国Sigma公司,D-MEM培养基和血清购于Gibcol公司。SAN由DMSO溶解制备成2mmol/L的储备液,-20℃下保存备用。1.2酶活剂即充填液取对数生长期的HeLa细胞和Siha细胞接种并培养于37℃、含5%CO2饱和湿度条件下24h。直接采用培养液稀释SAN到实验所需浓度。对照组则仅加DMSO,其浓度与最高SAN药物浓度组一致,但所有实验中DMSO含量均低于1/104。1.3mtt法确定了抗癫痫对细胞生长的影响1.3.1mtt法培养适合不同的细胞系统影响用0.25%的胰酶消化对数生长期的细胞,制备单细胞悬液,将5×104个/ml的HeLa细胞和Siha细胞分别接种于96孔培养板,每孔接种200μl。在37℃、含5%CO2和饱和湿度条件下培养24h后,加入浓度分别为0、0.1、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5和5.0μmol/L的SAN,每一浓度设6个复孔。然后在细胞继续培养24h后,加入20μl浓度为5mg/ml的MTT,再培养4h后轻轻吸掉培养基。加入100μlDMSO振荡溶解10min。在酶标仪上选取570nm主波长和630nm参考波长测定吸光度值,对照组细胞存活率设为100%,其余各组细胞存活率=(各浓度组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。1.3.2细胞存活率测定细胞同上法培养24h后,加入1.5μmol/L的SAN后分别于12、24、36、48和60h时测定细胞存活率。其他实验步骤同1.3.1中所述。1.4细胞毒性检测对数生长期细胞制备单细胞悬液,调整细胞浓度至1×106个/ml,将HeLa细胞和Siha细胞分别接种于直径为60mm的培养皿中,培养24h后加入0、0.1、0.5、1.0、2.0和3.0μmol/L的SAN,每一浓度设3个复孔。继续培养24h后用胰酶消化制备单细胞悬液,以500个细胞/皿接种至60mm的培养皿,每个计量点设3个平行样,培养14d后经PBS漂洗、甲醇固定、Gimsa染色。在显微镜下计数,含50个细胞以上的细胞集落作为一个克隆计数。1.5细痕的制备和生长抑制率的测定采用体外划痕方法测定细胞浸润能力。取对数生长期细胞,按1×106个/ml接种于6孔培养板培养至细胞完全饱和。用无菌的200μl的枪头垂直划出一无细胞的细痕,制作培养细胞伤口模型。接着用PBS小心清洗3次,去除漂浮细胞(此时作为划痕后零时),每孔加2ml培养基和0.5μmol/LSAN(此浓度对HeLa细胞和Siha细胞的生长抑制作用均<10%)。同时设阴性对照组,每组设3个平行样。对照组和0.5μmol/L剂量组分别培养24h和48h后显微镜下观察划痕宽度,数码照相机拍照,测量划痕宽度。1.6b指示系统s所有实验均重复3次以上,结果均以x±s表示。采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。组间比较采用方差分析,P<0.05表示有统计学意义。2结果2.1两组患者治疗前后hela细胞存活率的比较MTT比色法显示HeLa细胞和Siha细胞经SAN处理24h后,细胞生长出现明显抑制,并呈现剂量依赖性(图1)。例如,与未处理对照细胞相比(设为100%),0.5μmol/LSAN处理后,HeLa细胞的存活率为85.3%(P<0.05,95%CI为77.9%~92.8%);当SAN浓度增加为1μmol/L时,HeLa细胞的存活率降低到57.5%(P<0.01,95%CI为52.2%~62.8%);5μmol/LSAN处理后,HeLa细胞的存活率仅约为3%(P<0.01;95%CI为1.2%~5.7%)(IC50为4.86μmol/L)。而在1μmol/L和5μmol/LSAN处理后,Siha细胞的存活率分别约为72%和10%(P<0.01;95%CI分别为70.0%~75.9%和5.6%~11.5%)(IC50为5.95μmol/L)。显然,Hela细胞对SAN处理的敏感性比Siha细胞高。当我们将1.5μmol/LSAN加至细胞培养中,然后在处理后12、24、36、48和60h检测细胞存活率。结果发现,随着处理时间的延长,HeLa和Siha两种细胞的存活率都逐渐减小(图2),即呈明显的处理时间依赖关系。和图1结果一致,HeLa细胞较Siha细胞对SAN处理更为敏感。2.2两组细胞内克隆数的比较取500个细胞/皿接种培养14d后,对照组HeLa细胞和Siha细胞的克隆数分别达到33和33.3个,即大约15%的细胞克隆形成率。随着SAN浓度的增大,HeLa细胞和Siha细胞的克隆数则逐渐减少,呈明显的剂量依赖关系(图3)。如1.0μmol/LSAN处理24h后,HeLa细胞和Siha细胞的克隆形成数分别为14和16个,而当SAN浓度增加到3μmol/L时,HeLa细胞和Siha细胞的克隆形成数分别为2和3个,和对照组相比,SAN处理组的克隆形成数随着浓度的增加逐渐减低(P<0.05)。2.3两组“细胞口腔”宽度对比0.5μmol/LSAN处理HeLa细胞和Siha细胞48h后,对照组“细胞伤口”宽度分别为(0.51±0.04)mm和(0.64±0.02)mm,处理组“细胞伤口”宽度为(1.22±0.02)mm和(1.63±0.01)mm。两组分别相比,P<0.01和P<0.05。结果提示,SAN处理后显著抑制了HeLa细胞和Siha细胞的浸润和转移能力,即覆盖“细胞伤口”的能力,并呈时间依赖关系。体外划痕试验鏡下观察结果见图4。3化合物的体外生长作用宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤,中、晚期肿瘤的复发与转移是治疗失败的主要原因。因此,能更好地抑制肿瘤的生长及转移的新药成为当今肿瘤研究领域的一个热门研究方向。SAN是从传统中药罂粟科博落回中提取的一种生物碱,具有多种药理作用及用途。有研究发现,它具有广谱的抗菌作用,具有改善肝功能及增强免疫力的功能,对T淋巴细胞和B淋巴细胞都有刺激作用。近年来的研究表明,SAN在体外实验中对多种类型的肿瘤细胞如乳腺癌MCF-7细胞,前列腺癌LNCaP、DU-145和PC-3细胞、白血病K562细胞、胰腺癌AsPC和BxPC-3细胞和皮肤癌A431等有非常好的抑制生长的作用。我们将SAN直接加入HeLa细胞和Siha细胞培养液中24h后,MTT实验和克隆形成实验证实,SAN对HeLa细胞和Siha细胞的生长都有显著的抑制作用,并呈剂量依赖性,随着SAN浓度的增加,其细胞生存率随之逐渐下降,并且HeLa细胞较Siha细胞更为敏感。已有实验室研究表明,SAN的抗肿瘤细胞生长作用与细胞周期阻