江南卷柏药材的生药鉴定研究

江南卷柏药材的生药鉴定研究

江南柏树科。这是柏树科的一种植物。湖北省常用的民间草药和鄂西土家族民族药。具有凉血止血、清热利湿的功效;用于急性黄疸型肝炎、全身浮肿、癌症、肺结核、腹泻、淋病、小儿惊风、吐血、便血、崩漏、痔疮出血的治疗;外用治烧烫伤、外伤出血等症。《广西中药材标准》将其作为“石上柏”药材来源之一收载,用于癌症及多种炎症的治疗。1994年版《上海市中药材标准》则以“岩柏”之名收载。以本品为原料制成的岩柏注射液和江南卷柏片可用于各种出血和血小板、白血球减少及血小板减少性紫癜。江南卷柏所含化学成分以双黄酮和黄酮苷类为主,其中含量较高的穗花杉双黄酮具有抗肿瘤、抗病毒及血管舒张作用。江南卷柏和穗花杉双黄酮具有较强的抗柯萨奇病毒的活性。现有的各种江南卷柏药材标准中只有性状描述,而卷柏属植物极为类似,不利于有效控制江南卷柏药材的质量。为此,本文对江南卷柏药材进行了较系统的生药鉴定研究,为其质量标准的制定和应用提供依据。1高效液相色谱法测定实验药材于2006年8月和2009年9月采自湖北省宜昌雾渡河和鹤峰、恩施等地,由中南民族大学万定荣教授鉴定,并经中国科学院植物研究所张宪春研究员核实,为卷柏科植物江南卷柏SelaginellamoellendorffiiHieron.的全草。穗花杉双黄酮对照品(实验室自提,经测定质量分数达到99%);乙腈、四氢呋喃、三氟醋酸均为色谱纯,甲醇、乙醇、氯仿为分析纯,水为去离子水。戴安P680高效液相色谱仪,UVD170U检测器,四元梯度泵,HKZJZ-830171BAF戴安变色龙高效液相数据处理系统(美国戴安公司);AP-9908S过滤器(AutomaticScienceLastrumentCo.Ltd.);BP211D型十万分之一分析天平(德国Sartoriu公司)。2茎、茎、叶的显微特征取药材观察、测量和记录各部位的形态特征。茎上的纵棱、叶片形状、叶缘锯齿及孢子囊穗等形态特征的观察借助放大镜。本品长15~40cm,枝叶部分略卷缩。地下根茎横走并有分叉,密生4列卵状三角形鳞片状的叶。主茎略呈圆柱形,直径1~2mm,禾干色或浅黄色;茎下部不分枝,有卵状三角形的叶螺旋状疏生,贴伏于主茎上;茎上部3~4回分枝,分枝上的营养叶二型,背腹各2列。腹叶(中叶)疏生,叶多卷曲,淡灰绿色,展平后,中叶斜卵圆形,锐尖头,基部心形有膜质白边和微齿;背叶(侧叶)覆瓦状,卵圆状三角形,短尖头,有齿或下侧全缘。孢子囊穗短,四棱形,生于小枝端;孢子叶卵状三角形锐尖头,边缘有齿。茎质地较硬脆,易折断。略具草腥气,味淡、微涩。制作药材茎中段(距地面约10cm)的横切片、茎中部叶的表面片和药材粉末片进行观察,绘制茎横切面简图和详图、茎中部叶缘细胞特征图和粉末显微特征图。2.2.1茎横切面(直径1~2mm):呈类圆形或两端略尖的类椭圆形。表皮细胞1列,壁较厚。内侧为数列至10余列厚壁细胞;其内为较宽广的皮层薄壁细胞,排列紧密;内皮层不明显。气室长条形,长径820~1300μm,短径200~330μm。横桥多由5~10余个莲藕状薄壁细胞单列径向排列而成,个别由2~4列细胞组成。中柱长条形,被气室环绕;中柱鞘为2~4列薄壁细胞;维管束外韧型;木质部长条形,管胞壁木化。茎由基部至先端,各部细胞的列数及其大小逐渐减小。见图1和图2。根据多批药材茎的观察,基本特征与文献报道一致。2.2.2茎中部叶缘细胞:外侧具三角形刺状细胞,刺斜向伸出叶缘,刺长17~48μm,有的刺状细胞基部直接相连。刺状细胞内、叶缘外侧5~7列细胞长条形,细胞壁增厚,壁孔明显。其内侧的表皮细胞长梭形,壁呈微波状弯曲,且多见壁孔。见图3。茎的横切面和表面片中叶缘的细胞组织结构对江南卷柏与其混伪品的鉴别十分有效。尤其是叶表面片的制作十分简便,而叶缘细胞的特征对区分江南卷柏与细叶卷柏、薄叶卷柏十分简便,江南卷柏较内侧的表皮细胞多角形或长梭形,细胞壁呈微波状弯曲,而后二者较内侧的表皮细胞长梭形,壁呈深波状弯曲。2.2.3粉末:表皮细胞多为不规则多角形、不规则类方形或长条形;气孔不定式,直径15~30μm,副卫细胞5~7个;梯纹管胞直径约21μm;小孢子四分体、类圆球形,直径20~35μm,表面有颗粒状突起;木栓细胞常见。见图4。取江南卷柏药材粉末2g,加石油醚(60~90℃)40mL,加热回流40min,滤过。取滤渣再加乙酸乙酯40mL,加热回流40min,滤过,滤液浓缩至1mL,作为供试品溶液。另取江南卷柏对照药材2g,同法制成对照药材溶液。再取穗花杉双黄酮对照品,加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(2010年版中国药典一部附录ⅥB)试验,吸取上述溶液各2μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以1%的FeCl3乙醇溶液显色后,检视。供试品色谱中,在与对照药材和对照品相同位置上,显相同颜色的斑点。见图5。2.4试验方法与结果2.4.1色谱条件:DiamonsilC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(含3%四氢呋喃和3%三氟醋酸),A为乙腈,B为水相,梯度洗脱(0~5min,25%A;5~12min,25%~35%A;12~17min,35%~45%A;17~25min,45%~50%A;25~40min,50%~55%A;40~45min,55%~70%A;45~50min,70%~100%A;50~55min,100%A;55~60min,100%~25%A);流速:1.0mL/min;检测波长:330nm;进样量:20μL;柱温:30℃。2.4.2对照品溶液的制备:取穗花杉双黄酮对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含0.10mg的溶液,即得。2.4.3供试品溶液的制备:取江南卷柏药材粉末(过20目筛)约1g,精密称定,置索氏提取器中,加氯仿适量,加热回流4h,取出药材,挥干氯仿,转入100mL圆底烧瓶中,精密加入45mL甲醇,水浴回流提取2次,每次1h,合并收集提取液,冷至室温后,用甲醇定容至100mL容量瓶中,摇匀,滤过,再用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。2.4.4标准曲线的制备:配制含穗花杉双黄酮对照品溶液(0.10mg/mL)2.0、4.0、6.0、8.0和10.0μL的标准系列溶液,分别按“2.4.1”项下色谱条件下进行测定。以对照品的进样量和穗花杉双黄酮的峰面积绘制标准曲线,得线性回归方程为Y=72.674X-1.9913(r=0.9999)。表明穗花杉双黄酮在0.2~1.0μg范围内线性关系良好。2.4.5稳定性、精密度、重复性试验:分别按规定进行8h内的稳定性试验、仪器精密度试验和同一批号5份样品的重复性试验,穗花杉双黄酮色谱峰峰面积RSD值分别为1.4%、1.3%和3.3%。2.4.6加样回收率试验:精密称取6份已知含量的样品粉末各0.5g,分别准确加入一定量的穗花杉双黄酮对照品,按按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液并测定含量,计算回收率。结果见表1。2.4.7样品测定及含量限度的确定:按上述供试品溶液的制备方法和测定条件,测定了3批不同采收时间的药材中穗花杉双黄酮的含量。结果见表2。根据3批样品含量测定结果,暂定本品含穗花杉双黄酮不得少于0.30%。3表皮细胞特征本文观察了江南卷柏药材的显微特征,证实茎的横切面组织结构和茎中部叶的叶缘细胞特征能与其同属多种近缘药用植物区别开,对江南卷柏与其混伪品的鉴别十分有效。其中,叶表面片的制作十分简便,在叶缘细胞特征中江南卷柏较内侧的表皮细胞细胞壁呈微波状弯曲,而其近缘植物细叶卷柏、薄叶卷柏较内侧的表皮细胞壁呈深波状弯曲,该特征可以作为药材鉴别的重要依据。江南卷柏由于是全草类药材,制作粉末片存在均匀性和稳定性等问题,粉末特征仅可作为参考依据,粉末特征中,叶缘细胞特征仍然是重要依据。本文建立了江南卷柏药材和所含主要成分穗花杉双黄酮的TLC鉴别方法和HPLC测定穗花杉双黄酮含量的方法,并对3批江南