液相色谱法测定中华绒螯蟹中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留

液相色谱法测定中华绒螯蟹中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留

诺氟沙星（nor）、环丙沙星（cip）、恩诺沙星（enr）和其他一般氟沙星（quinolos，qns）药物在食品中的残留受到公众的关注。由于QNs是治疗人类疾病的一类重要药物,NOR、CIP-HCl、ENR等在水产动物体内的残留,不仅直接威胁了公共卫生安全和生物安全、污染了自然环境,还严重影响了我国主要水产品的对外出口贸易。近年来,日本、欧盟等对我国鳗、对虾出口的绿色壁垒就是最好的应证。建立灵敏、快速、准确且与国际检测标准接轨的检测方法是检测和监控QNs药物的重要技术保障。对于其主要检测方法之一的高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)而言,样品前处理不仅可以起到富集痕量组分、去除杂质干扰、提高方法灵敏度的作用,还可以去除对仪器或分析系统有害的物质,延长仪器使用寿命。另外,水产品品种的多样性及其不同组织成分的复杂性也对建立合适的前处理方法提出了挑战。笔者针对NOR、CIP和ENR的特点,以中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)为检测对象,综合考虑灵敏度、准确性、重复性、经济适用性等方面因素,对国内外常用HPLC检测NOR、CIP和ENR的方法及前处理提取溶剂、净化、浓缩富集等一系列方法和条件进行了比较研究,旨在为相关检测方法的建立和标准的制定提供参考。1材料和方法1.1测量前的样品试验中所采用的样品为中华绒螯蟹可食用部分。1.2超声波破碎法Agilent1100高效液相色谱仪,配荧光检测器;KINEMTICAAG高速组织捣碎机;超声波破碎仪;ODSC18固相萃取柱(10mg)。NOR、ENR恩诺沙星原料药:纯度为97.5%,浙江医药股份有限公司产品;CIP标准品:纯度≥99.0%,Sigma公司产品。1.3流动相、激发波长色谱柱:RP-ODSC18柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈+0.01mol/L的四丁基溴化铵(磷酸调pH值为3.1)=5+95(V/V);激发波长:280nm,发射波长450nm;流速1.5mL/min,柱温40℃,进样量20μL。1.4标准曲线的绘制分别配制不同浓度梯度的NOR、CIP和ENR(先加0.5mol/L盐酸5mL溶解)标准溶液,上色谱柱,以峰面积为纵坐标,药物浓度为横坐标制作标准曲线。1.5腈乙腈提取溶剂取空白样品5g,添加适当浓度NOR、CIP和ENR标准溶液,分别加入30mL的甲醇、乙腈和酸化乙腈(乙腈+50%盐酸=2500+20)提取溶剂,高速组织捣碎机匀浆,充分振荡15min,4500r/min离心15min,取上清液。往残渣中加入提取溶剂30mL,重复上述操作1次,合并上清液,测定回收率和批间样品的相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)。1.6研磨匀浆和超声破碎提取方式的影响取加入标准品的样品,以酸化乙腈为提取溶剂,组织捣碎机匀浆,比较研磨匀浆、摇床振荡(120r/min振荡15min)和超声波(100W,22.5kHz处理5min)破碎3种提取方式对回收率的影响。1.7采用净洁法影响回收率1脱水程序对回收率的影响分别在加标样品提取前和提取后加入3倍样品质量的无水硫酸钠作为脱水剂,以乙腈为提取溶剂,采用摇床振荡的提取方式,比较脱水程序对回收率的影响。2样品的制备采取2种方法对样品进行浓缩、净化,比较2种方法对检测灵敏度和回收率的影响。方法Ⅰ:加标样品加入3倍样品质量的无水硫酸钠脱水,经本文中“1.5”步骤用乙腈提取,加入正己烷30mL去脂,下层乙腈层55℃旋转蒸发至干,用1.3中的流动相1mL洗涤残渣,4500r/min离心3min,取上清,经0.45μm微孔滤膜过滤,取20μL上色谱柱。方法Ⅱ:加标样品加入3倍样品质量的无水硫酸钠脱水,经本文“材料与方法”中“1.5”步骤用乙腈提取,加入正己烷30mL去脂,萃取液过ODSC18柱纯化。小柱预先依次用甲醇3mL、20%甲醇2mL、40%甲醇3mL进行活化。加入样品萃取液后,用甲醇洗脱,蒸干洗脱液,并用流动相0.5mL溶解,经0.45μm微孔滤膜过滤,取20μL上色谱柱。2结果与分析2.1加入nor、cip和enr标准品的中华绒螯蟹组织样品NOR、CIP和ENR标准品色谱图见图1,标准品浓度为10μg/mL。其中,NOR保留时间约为4.8min,CIP的保留时间约为5.5min,ENR的保留时间为9.4min。加入NOR、CIP和ENR标准品的中华绒螯蟹组织样品色谱图见图2,加标样品浓度为5μg/kg。图1和图2色谱图均基线平稳,药物峰分离效果良好。2.2标准曲线见表1NOR、CIP和ENR的标准曲线如图3所示。NOR、CIP和ENR分别在0.02～5.00μg/mL、0.004～4.000μg/mL和0.02～5.00μg/mL范围内线性关系良好;标准曲线分别为y=61.803x-0.580、y=73.620x+0.425、y=78.343x-1.024;相关系数分别为0.9996、0.9983和0.9999。2.3样品含量对提取剂回收率的影响分别采用甲醇、乙腈和酸化乙腈作为提取溶剂,测定回收率,结果见表1。当样品中加入标准品的浓度为5μg/kg、10μg/kg和15μg/kg时,采用酸化乙腈提取NOR、CIP和ENR的回收率与采用甲醇作为提取剂的回收率差异显著。酸化乙腈与甲醇、甲醇与乙腈作为提取溶剂均表现出差异,但差异不显著。2.4测定频率和测定结果率分别采用研磨匀浆、摇床振荡和超声波破碎的方法测定回收率,测定结果见表2。其中,当样品中加标浓度为5μg/kg、10μg/kg和15μg/kg时,3种提取方法的回收率均表现出差异,但差异不显著(P>0.05)。2.5种脱水方法的比较分别采用提取前和提取后加入脱水剂2种不同脱水程序,对回收率的影响见表3。2种脱水方法表现出显著性差异(P<0.05)。其中,对加标浓度为5μg/kg时的CIP、ENR和对加标浓度为10μg/kg的NOR、CIP和ENR的回收率的影响,表现出极显著性差异(P<0.01)。2.6种净化方法的比较净化效果的测定结果如表4所示。方法Ⅰ和方法Ⅱ2种净化方法有差异,但差异不显著。净化效果如图4所示,采取2种净化方法均能有效去除杂质,药物峰分离良好,无干扰。2.7最低检测限的确定采取在提取前用无水硫酸钠作脱水剂、酸化乙腈作提取剂,振荡提取,正已烷去脂,旋转蒸发浓缩并离心的前处理方法,根据2倍噪音确定最低检测限,CIP和ENR的最低检测限分别为5.0μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg。3社会需求原则科学、合理的检测方法不仅要考虑技术要求(如:灵敏度、准确性、重复性、适用性等),还必须充分考虑社会需求(如推广性、实用性、经济性等)。样品前处理包括提取、净化、浓缩或衍生化等步骤。水产动物种类众多、组织成分复杂,对前处理技术的要求也更加特殊。3.1药物提取溶剂提取溶剂的选择不但要遵循“相似相溶”规则,还要充分考虑溶剂性质对随后处理步骤的影响(如:对待测药物的选择性;对回收率、检测灵敏度等参数的影响和方法的便捷等)。NOR、CIP和ENR等喹诺酮类药物分子结构中均有4-喹诺酮母核,属于酸碱两性化合物,易溶于缓冲溶液和甲醇、乙腈等水溶性有机溶剂。为了提高检测灵敏度,一般会采取浓缩步骤。采取缓冲溶液作为提取溶剂增加了随后进行的浓缩步骤的难度,不利于简化前处理步骤。本试验未采用缓冲水相溶液作为提取溶剂,而是采取水溶性的有机溶剂作为提取剂。试验结果表明:酸化乙腈提取效果最佳,乙腈次之,甲醇较差。该结果与李俊锁等的观点一致:甲醇、乙腈虽然提取效果好、适用范围广,但对目标药物的选择性不强,提取的杂质较多,造成进一步萃取时乳化现象较严重时,在一定程度上会影响回收率,而采取混合提取剂可有效避免该问题。3.2提取方法比较目标药物的提取方法是一个促进目标药物、样品基质和溶剂三者相互作用的过程。为了充分提取目标药物,可采取提高样品破碎程度、增加扩散面积、减少扩散距离、提高扩散速度、降低溶剂黏度、提高温度等方法来实现。在溶剂和提取环境确定的情况下,提高样品的破碎程度和重复提取成为步骤的关键。常规的提取方法有匀浆法、超声波辅助提取法(sonication-assistedextraction,SAE)、振荡法,、索氏提取法(soxhletextraction)、超临界流体萃取法等。研磨匀浆对操作人员依赖较强,增大了偶然误差的几率,这也是造成本试验中研磨提取方法的重复性不好的原因。超声波辅助提取法自动化程度高,适合多批次样品的同时处理,对颗粒较小的样品尤其合适。本试验结果显示:采用超声波辅助提取法提取水产品组织中的诺氟沙星、盐酸环丙沙星和恩诺沙星,回收率偏低(表2),其原因可能是由于水产品待检组织(如肌肉等)未经过破碎等预处理,超声波无法将其混合均匀,药物提取不充分。本文利用摇床进行振荡提取不同水产品组织中的诺氟沙星等3种药物,回收率和重复性均令人满意,符合药物残留检测的技术要求。该结果与王晶等的观点相似:振荡法与索氏提取法提取效率相当。目前日本的食品分析方法几乎都采用振荡法,也进一步证实了这一结论的可靠性。索氏提取法和超临界流体萃取法需要特殊的设备或需要经过高温,不适于大规模检测水产品中NOR等喹诺酮类药物残留。3.3提取与水分、活性笔者采用无水硫酸钠为脱水剂,分别在药物提取前和提取后脱水,结果表明:2种不同的脱水程序差异显著,提取后脱水,3种药物的回收率均较低。这是由于NOR、CIP和ENR是水溶性药物,提取后再脱水则药物会随水分的脱去而损失,从而导致回收率偏低。在药物提取前加入无水硫酸钠进行脱水,既去除了水分又能保证药物被充分提取且不损失。另外,值得注意的是,无水硫酸钠吸水会凝结成块,从而影响后续操作,因此在脱水步骤时操作要迅速,且不宜同时脱水处理过多的样品。3.4样品的分析结果净化和浓缩是降低检测限的重要手段。净化步骤应依据目标药物和杂质的不同理化性质(如极性、溶解性、酸碱性、分子量等)而定,包括脱水、脱蛋白、脱脂肪等程序。浓缩是为了除去净化过程中引入的溶剂、适当提高处理样品中目标药物的浓度,常见的方法包括旋转蒸发和氮气吹干等。本文采用2种不同的净化方法处理样品,色谱图表明:方法Ⅰ处理的样品中杂质较多;方法Ⅱ中杂质去除较为彻底;但都不影响目标药物的分离,3种药物峰均分离良好。回收率和精密度试验也证明:经过2种净化方法处理,3种目标药物回收率和重复性也令人满意,适合测定水产品中NOR、CIP和ENR的残留。值得指出的是,方法Ⅱ使用的固相萃取方法是一项快速、简便的新型净化技术,但其耗材成本相对较高、对操作人员技术水平要求较高(如小柱类型的