hplc法同时测定侧柏叶中4种有效成分的含量

hplc法同时测定侧柏叶中4种有效成分的含量

侧柏叶是柏树科的一种干燥的侧柏（l.）franch。具有冷血止血、祛痰止咳、毛发发芽等功效。它经常用于止血、出血、止血、出血、崩漏出血、肺热咳嗽、出血、毛发早白等症状。主要含有挥发油、黄酮、鞣质和无机元素等成分,具有抑菌、抗炎、止血、镇咳祛痰、抗肿瘤和抗红细胞氧化等药理作用［2］。其中黄酮及双黄酮类是其特征性成分,也是活性成分。研究表明双黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤以及抗高血压等方面的药理学作用［3］。随着侧柏叶在保健和药品行业的广泛应用,对侧柏叶质量进行有效的控制显得尤为重要。《中华人民共和国药典》2010年版一部侧柏叶项下规定了槲皮苷的含量［1］;罗世恒等采用HPLC法测定了杨梅苷的含量［4］;LUYan-hua等同时测定了槲皮苷、槲皮素、芦丁和穗花杉双黄酮的含量,结果表明芦丁和槲皮素的含量分别为0.028%~0.1%和0.014%~0.036%［5］,研究发现侧柏叶中芦丁和槲皮素的含量较低,而杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮(化学结构式见图1)的含量较高,均可作为指标成分进行测定。为了有效的控制侧柏叶质量,本文作者采用HPLC法同时测定侧柏叶中的4种黄酮的含量,该法简便、准确,适用于侧柏叶药材的质量分析和控制,为其质量评价提供可靠的依据。1药品、试剂和仪器LC-10AB高效液相色谱仪、SPD-10PDA检测器、Class-VP工作站(日本岛津公司),槲皮苷对照品(中国药品生物制品鉴定所,批号111538-20050),杨梅苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮(自制,纯度质量分数均大于98%),甲醇(色谱纯,天津康科德科技有限公司),纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司),其他试剂(分析纯,市售)。15批侧柏叶药材经辽宁省食品药品检验所王维宁主任药师鉴定为侧柏(Platycladusoriental-is(L.)Franco)的叶。2方法和结果2.1u3000酸洗脱程序、流速、检测波长色谱柱:WatersODSC18柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相:甲醇(A)-体积分数0.5%乙酸溶液(B);梯洗脱程序:0~5min65%~55%B,5~20min55%~45%B,20~25min45%~35%B,25~30min35%~30%B,30~40min30%~20%B,40~50min20%~5%B;流速:0.8mL·min－1;检测波长:340nm;柱温:室温;进样量:20μL。2.2液相色谱法测定在“2.1”条色谱条件下,分别精密吸取对照溶液和供试溶液20μL,注入液相色谱仪,测定结果见图2。结果表明,供试溶液中4种被测成分的色谱峰与相邻峰之间分离度为1.2~1.8,对称因子在0.95~1.05内,理论塔板数按槲皮苷计算不低于5000。2.3甲醇溶液的制备取本品粉末约0.2g,精密称定。加体积分数为85%甲醇溶液25mL,精密称定质量,回流提取0.5h,放冷,再精密称定质量,用体积分数85%甲醇溶液补足减失的质量,摇匀。经0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。2.4对照储备溶液精密称取杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮对照品10.2、13.2、4.75和9.43mg,分别置于10mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,摇匀,制成质量浓度分别为1.02、1.32、0.475和0.943g·L－1的对照储备溶液。分别精密吸取上述对照储备溶液3、4、3和4mL置于同一25mL量瓶中,摇匀,制成含杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮质量浓度分别为122.4、211.2、57.0和150.8mg·L－1的混合对照溶液,即得。2.5标准曲线的绘制取“2.4”条中的混合对照溶液适量,用甲醇稀释成系列质量浓度的混合杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮对照溶液,按“2.1”条色谱条件测定。以对照品质量浓度(ρ,mg·L-1)为横坐标,以峰面积(A)为纵坐标,绘制标准曲线。结果杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮回归方程分别为A=4.000×107ρ-2.078×105(r=0.9998),A=4.000×107ρ-2.691×105(r=0.9998),A=9.000×107ρ-1.866×105(r=0.9999)和A=2.000×107ρ-1.150×105(r=0.9998)。表明杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮质量浓度分别在61.20~122.4mg·L-1(r=0.9998)、10.56~211.2mg·L-1、2.85~57.0mg·L-1和7.54~150.8mg·L-1内线性关系良好。2.6计算相对标准偏差取“2.4”条下混合对照溶液适量,按“2.1”条色谱条件重复进样5次,记录色谱图,按峰面积(A)计算相对标准偏差。结果杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮峰面积的RSD分别为0.33%、0.24%、0.23%和1.1%,表明仪器精密度良好。2.7进样的测定取同批供试品(No.7)6份,按“2.3”条方法制备供试溶液,并按“2.1”条色谱条件进样分析。结果杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮含量的RSD分别为2.1%、2.2%、1.3%和3.3%,表明方法重复性良好。2.8峰面积的rsd取供试品(No.7)适量,按“2.3”条方法制备供试溶液,室温下放置,并按“2.1”条色谱条件于0、4、6、8和12h测定。结果杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮峰面积的RSD分别为1.6%、1.2%、1.4%和1.9%。表明供试溶液在室温下12h内稳定。2.9加样回收率试验精密称取供试品0.1g(No.7)6份,分别精密加入对照储备液适量,按“2.3”条方法制备供试溶液,按“2.1”条色谱条件,依法测定,计算回收率,结果见表1。2.10不同产地黄酮含量的比较取各批药材适量,按“2.3”条方法制备供试溶液,按“2.1”条色谱条件分别进样测定,计算药材中杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮的含量,结果见表2。结果表明,杨梅苷的含量质量分数在0.18%~0.31%内,槲皮苷的含量质量分数在0.51%~0.92%内,穗花杉双黄酮的含量质量分数在0.06%~0.11%内,扁柏双黄酮的含量质量分数在0.26%~0.50%内。不同产地的4种黄酮之和的含量质量分数在1.05%~1.70%内。表明不同产地、不同采收期的4种被测成分的含量有一定差异。3提取溶剂、流动相和供试品的选择a.侧柏叶为柏科裸子植物,黄酮类及双黄酮类是其特征性成分,也是有效成分。本研究表明杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮的含量较高,可以作为侧柏叶的指标成分控制其质量。b.提取条件的选择:用同一种提取方式,分别用甲醇和乙醇考察同一供试品,结果发现甲醇的提取率要高于乙醇提取率,故最后选择用甲醇作为最后的提取溶剂。分别用超声、加热回流和振荡提取考察同一供试品,结果发现加热回流提取的提取率要远高于超声和振荡的提取率,故最后选择加热回流提取的方法。分别用体积分数为50%、70%、80%、85%和90%的甲醇溶液为提取溶剂,结果体积分数为85%的甲醇溶液提取液中槲皮苷、杨梅苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮的色谱峰峰面积大,故采用体积分数为85%的甲醇溶液作为提取溶剂。c.流动相的选择:由于侧柏叶药材的化学成分复杂,故选择了梯度洗脱系统。为了防止色谱峰拖尾,故在流动相中加入酸。在流动相的筛选中,尝试过甲醇-乙酸水、甲醇-磷酸水和乙腈-乙酸水系统。考虑到乙腈的价格比较昂贵且毒性较大,而甲醇-乙酸水系统基线稳定,峰形较好,且有较好的分离度,因此最终选择甲醇-体积分数0.5%乙酸水系统为HPLC分析的流动相。d.通过DAD检测器进行紫外区全波长扫描,结果表明杨梅苷在256nm和352nm处有最大吸收,槲皮苷在254nm和350nm处有最大吸收,穗花杉双黄酮在240nm、270nm和340nm处有最大吸收,扁柏双黄酮在240nm、270nm和340nm处有最大吸收。经计算杨梅苷和槲皮苷在最大吸收波长354nm和350nm处的含量与在340nm处含量差别不大,所以选择340nm作为检测波长。e.供试品含量测定的结果表明,15批药材中槲皮苷的含量质量分数均在0.10%以上,符合《中华人民共和国药典》的规定。含量测定结果显示,槲皮苷的含量质量分数在0.51%~0.92%内,与单鸣秋等［6］研究槲皮苷的含量不低于0.5%的结果一致。为了更好的控制和提高侧柏叶的质量,根据测定结果,建议《中华人民共和国药典》提高侧柏叶中槲皮苷含量的