卷柏及垫状卷柏hplc指纹图谱研究

卷柏及垫状卷柏hplc指纹图谱研究

柏树是科维托科的一种约700种植物。它分布在世界各地。中国约有50多种药物，25种药物已经被发现。《中国药典》2010年版收载为卷柏科卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring和垫状卷柏Selaginellapulvinate(Hook.EtGrev.)Maxim的干燥全草。由于卷柏属植物外形相似不易辨别,近年来卷柏的指纹图谱研究成为一个热点。卢平华等研究了江南卷柏及同属植物的HPLC指纹图谱,得到了18个特征峰,并比较了其他同属植物及江南卷柏的指纹图谱,结果显示黑顶卷柏、薄叶卷柏、翠云草不宜与江南卷柏混用。范晓磊等对卷柏属近10个药用植物的HPLC指纹特征进行了研究,但所选各药材只来源于一或两个产地。郑玉胜等对卷柏药材进行了HPLC指纹图谱研究,但研究对象仅为卷柏Selaginellatamariscina。对于多产地的卷柏及垫状卷柏的指纹图谱对比研究未见报道。因此本研究对20批来自不同产地的卷柏及垫状卷柏的HPLC指纹图谱进行研究及比较,丰富了卷柏属的指纹图谱信息。《中国药典》对卷柏的含量测定规定用HPLC方法测定其主要成分穗花杉双黄酮的含量,规定不能少于0.3%。本研究目的在于进一步完善中国药典对卷柏中穗花杉双黄酮含量测定的方法。1超声检测仪器Aglient1100高效液相色谱仪,BP211D型电子天平(SatoriusCo.Ltd.,德国),KQ-250DB数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。乙腈为色谱纯,水为纯净水,其他试剂均为分析纯。穗花杉双黄酮由本实验室提供,纯度大于98%。药材样品来源见表1,所用样品均由中国药科大学王强教授鉴定。2方法和结果2.1流动相a-乙腈相穗花杉双黄酮定量色谱条件:色谱柱ShimpackC18柱(150mm×4.6mm,5μm),预柱为ZORBAXC18柱(4.6mm×12.5mm,5μm);检测波长330nm;柱温30°C;流速1.0mL/min;进样量20µL。流动相:0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)(67:33)。指纹图谱色谱条件:色谱柱LichrospherC18(4.6mm×150mm,5μm)),预柱为ZORBAXC18柱(4.6mm×12.5mm,5μm);检测波长330nm;柱温30°C;流速1.0mL/min;进样量20µL。流动相:0.31%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脱:0~10min,30%~37%B;10~20min,37%B;20~35min,37%~57%B;35~60min,57%~90%B。2.2对照品溶液的配制精密称取1.634mg的穗花杉双黄酮对照品,置10mL量瓶中,加入适量甲醇充分溶解后,定容至刻度,配成0.1643mg/mL的对照品溶液。2.3%乙醇用量对续滤液制备的影响取药材粉末(过4号筛)约0.2g,精密称定,置50mL量瓶中,加70%乙醇适量,超声2h,放冷至室温,用70%乙醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液即得。2.4方法研究2.4.1线性回归分析精密吸取穗花杉双黄酮对照品溶液0.1、0.5、1、1.4、2、3、4mL,置10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,依次进样,按上述色谱条件测定,记录色谱图,以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归分析,得线性回归方程:Y=28241X-28.448(r=0.9997),表明穗花杉双黄酮峰面积与进样量在0.00821~0.329μg有良好的线性关系。2.4.2共有峰的相对峰面积穗花杉双黄酮定量分析中,精密吸取上述穗花杉双黄酮对照品溶液20μL,重复进样5次,测定峰面积,结果RSD为0.80%。HPLC指纹图谱研究中,取同一供试品溶液,连续进样5次,考察指纹图谱中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果显示,共有峰的相对保留时间RSD均小于4.0%,相对峰面积的RSD均小于5.0%。表明仪器精密度良好。2.4.3穗花杉双黄酮峰面积测定穗花杉双黄酮定量分析中,取同一样品5份,按样品溶液制备方法制备5份样品溶液,各进样20μL,测定穗花杉双黄酮峰面积,计算,RSD为2.21%。HPLC指纹图谱研究中,取同一样品5份,按样品溶液制备方法制备5份样品溶液,依法检测各指纹图谱,计算,其共有峰的相对保留时间的RSD小于4%,相对峰面积的RSD不超过5%,表明其重复性良好。2.4.4指纹图谱检测波长穗花杉双黄酮定量分析中,取同一份供试品溶液依次在0、4、8、12、24、48h测定,计算RSD为1.91%。HPLC指纹图谱研究中,取同一份供试品溶液依次在0、4、8、12、24、48h测定,得到其共有色谱峰的相对保留时间的RSD均小于4%,相对峰面积的RSD均小于5%。表明供试品溶液在室温下48h内稳定。2.4.5加样回收率试验精密称取已知穗花杉双黄酮含量的同一样品6份,每份约0.1g,分别加入穗花杉双黄酮16.43μg,按“2.3”项下方法制得供试品溶液,按上述色谱条件测定,计算回收率,结果平均回收率为101.6%,RSD为2.32%。2.5穗花杉双黄酮指纹图谱的测定将卷柏及垫状卷柏的20批样品的供试液,按上述穗花杉双黄酮定量色谱条件及指纹图谱条件进样分析,记录各组色谱图。结果见表2,色谱图见图1、图2。2.6相似度的评价根据药国家典委员会的指纹图谱相似度评价软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》处理,得到10批卷柏及10批垫状卷柏药材的相似度评价结果,结果见表3、表4。根据相似度计算结果,10批卷柏药材的相似度均在0.997~1之间,10批垫状卷柏药材的相似度均在0.923~1之间,说明不同产地不同批次的药材的相似度较高。3垫状卷柏与卷柏的对比3.1本研究对含量测定的提取方法进行了考察,分别考察了超声、加热回流及索氏提取,包括超声提取0.5h、1h及2h;加热回流提取2.5h、3.5h及5h;索氏提取2h及3h。考虑到《中国药典》规定穗花杉双黄酮含量不得低于0.3%及提取方法的简易性,选择了超声提取2h为药材的提取方法。3.2本研究建立了卷柏及垫状卷柏的HPLC指纹图谱。以穗花杉双黄酮为参照峰,卷柏中共标定了7个共有峰。共有峰的峰号(相对保留时间):2(S,1.000),3(1.229),4(1.712),6(1.909),7(2.248),8(2.384),9(2.759);垫状卷柏中共标定了6个共有峰。共有峰的峰号(相对保留时间):1(0.696),2(S,1.000),3(1.234),4(1.708),5(1.810),6(1.896),7(2.231)。由指纹图谱可以看出,卷柏及垫状卷柏中均含有2、3、4、6、7号峰,其中2及6号峰为主要特征峰。卷柏同垫状卷柏相比,2号峰高,其它峰含量相似,并多出8、9号两个峰。垫状卷柏则多出1、5号峰。说明二者中所含有的成分大体相同,只在个别微量成分上不同,表明将两者同时入用为卷柏的原药材存在一定的合理性。由于研究中只收集了各10批卷柏及垫状卷柏药材样品,所获得的信息只能反映部分产地卷柏及垫状卷柏药材的质量。3.3卷柏及垫状卷柏的指纹图谱显示,二者的主要成分穗花杉双黄酮(2号峰)含量相差较大,因此本文就卷柏及垫状卷柏中的穗花杉双黄酮的含量进行了