振动刺激对大鼠腓肠肌myf-5表达的影响

振动刺激对大鼠腓肠肌myf-5表达的影响

骨肌肉在机械强度的作用下具有相应的体积，具有快速适应外部环境变化的特点。然而，在振动、固定、运动减少和肌肉严重丧失的情况下，骨肌肉的功能降低，肌肉使用的减少，即smda。目前,在废用性肌萎缩的防治措施方面,国内外学者们进行了多种途径的探索。废用性肌萎缩发生后,用到的康复方法有:电刺激、肢体牵拉、运动训练以及振动刺激等。传统康复方法有外界刺激、主动运动和被动运动疗法,如电刺激、机械牵拉刺激、传统的中医针灸火罐治疗等;药物疗法,如激素类、受体激动剂、中医中药类等;振动刺激作为一种外源性刺激,可以刺激骨骼肌内部的初级肌梭本体感受器,特别是初级肌梭传入纤维末梢的兴奋性,导致神经发放冲动强度增大、频率加快、以及内耳前庭机械感受器和神经中枢机制发生变化,通过多突触传导的调节作用,使快、慢肌发放冲动的频率尽量接近一致,提高运动神经元发放冲动的同步性。前期研究结果表明振动刺激对于萎缩肌肉的形态学恢复有着明显效果。振动刺激对于肌力、本体感觉能力的增强均有一定的积极作用。因此,本研究将其应用于废用性肌萎缩的康复干预过程中,从分子生物学角度进行实验研究,考察振动刺激对萎缩肌细胞的蛋白基因表达的影响。1研究对象和方法1.1大鼠睾丸悬吊的预防选用8周龄40只健康、无呼吸道感染、无运动障碍及无皮肤病的成年Sprague-Dawley品系雌性大鼠(选择雌性大鼠是为了避免雄性大鼠尾部悬吊时,由于睾丸供血障碍或睾丸回缩入腹腔影响雄激素分泌水平,进而影响骨骼肌的合成代谢)。体重(240±10.3)g,所有大鼠采用8只/笼喂养,悬吊训练时1只/笼,室温维持在21℃~24℃;人工智能控制动物房室内照明,每昼夜保持12h黑暗与照明交替循环,并保证能自由进食和饮水。动物适应性饲养14天后,按随机分配原则分为5组,每组8只。1.2学习方法1.2.1试验对象组动物适应性饲养后,随机分为5组:正常对照A组,低频振动B组,高频振动C组,悬吊D组,自然恢复E组,每组8只,具体分组情况见表1。1.2.2振动刺激训练失重大鼠SMDA模型采用尾部悬吊模拟方法进行:该模型设置方法为实验大鼠身体长轴与水平面呈30°、后肢悬空、前肢着地、尾部悬吊,悬吊同时动物在笼内可以自由饮水、活动、进食;尾部悬吊训练满14天后,解除每组大鼠悬吊开始进行各种频率的振动刺激训练。本实验设计使用了固定软瓶以确保在振动期间大鼠双侧下肢保持直立状态,振动训练过程大鼠能够保持站立在振动台上,头可伸直,保持自由,身体直立,不影响正常呼吸;本实验选择20Hz作为振动训练的低频频率,振动负荷为10min/次,振幅设定为3mm;次间歇时间为5min,2次/天,5次/周×2周。高频组使用方法、设备同上,但以30Hz作为振动训练的频率,自然恢复组尾部悬吊2周后,自然恢复2周,不做任何外加恢复手段。1.2.3肌纤维类型的检测本实验以大鼠腓肠肌(GastrocnemiusGAS)为代表来观察和研究废用性肌萎缩的发生和变化。各组实验大鼠以戊巴比妥钠腹腔麻醉(45mg/kg),腹腔注射后迅速解剖取出大鼠双侧腓肠肌以100g体重标准化,称其湿重所得数据作为腓肠肌肌湿重体重比;应用肌纤维mATPase染色法鉴定肌纤维类型,观察视野内肌纤维的mATP酶活性,作定性描述。切片厚度为10μm;采用图像分析系统对各组大鼠的每一腓肠肌肌组织各随机抽取1张接近肌腹中部的切片,并对各型肌纤维的细胞数进行定量分析,切片在400倍光镜下随机对10个视野进行观察,计算出每个视野内各型肌纤维数,并计算各型肌纤维的构成比,得大鼠肌纤维数的均值。1.2.4sds-计划电泳分离本实验采用westernblotting印迹法对所测定Myf-5蛋白进行定量分析。先将蛋白通过SDS电泳分离开来,利用抗原抗体的免疫反应,再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体(NC膜)上,然后再加抗体形成抗原抗体复合物,利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上,用灰度分析出每组结果的均值。1.2.5数据统计分析使用Excel2007软件进行数据记录和归档整理,采用SPSS17.0软件对实验数据进行单因素方差分析(OneWayANOVA),所有实验数据均以均数士标准差(M士S)表示,P<0.05为显著性水平,P<0.01为非常显著性水平,各组间采用Pearson法作相关分析。2结果2.1肌向慢肌转化的趋势经过2周悬吊训练之后,各组大鼠Ⅰ、Ⅱ型肌纤维数量实验数据见表2,大鼠腓肠肌肌纤维构成比即有明显改变,Ⅰ型肌纤维的构成比减少,Ⅱ型肌纤维的构成比增加;自然恢复组和振动刺激组肌纤维类型都有从快肌向慢肌转化的趋势。其中,低频恢复组Ⅰ型肌纤维恢复较多,与对照组相比有非常明显差异(P<0.01);而高频恢复组Ⅰ型肌纤维恢复较少,未达到对照组水平,自然恢复E组与A组则没有选择性差异;尾部悬吊14d后,B、C组与D组相比,在Ⅰ型肌纤维构成上B组有非常明显差异(P<0.01),而C组有显著性差异(P<0.05);在Ⅱ型肌纤维B组与D组相比都有着非常明显差异(P<0.01),而C组没有显著性差异;在总数上,低频恢复B组与A组对照组有非常明显差异(P<0.01),而高频恢复组C组与A组对照组则没有明显差异,并且在总数上B组有着明显的增长趋势,C组则没有明显变化。2.2悬吊后蛋白表达变化在本实验中,各组大鼠经过14天悬吊训练之后,MyoF-5含量的westernblotting蛋白表达印迹见图1,悬吊组D组与A组相比蛋白表达很低,预示着悬吊训练之后蛋白表达明显下降,而B、C两组与对照组A组相比有着明显增大的趋势变化,与自然恢复组E组相比也有着显著性差异,趋势一样,并且B组比C组的趋势更加明显,B组有非常明显差异(P<0.01),C组则有明显差异(P<0.05),见图1、表3。各组大鼠MyoF-5蛋白表达水平实验数据的变化趋势见表3。3环-螺旋结构生肌调节因子(MRFs,又称为成肌因子)由MyoD、MyoG、Myf-5、MRF4等4个家族成员组成,具有极其相似的结构特征。Myf-5的氨基酸序列特征是一个紧邻的B-螺旋-环-螺旋结构(HLH)和一个含有赖氨酸、精氨酸的碱性区,碱性区是与螺旋DNA相结合。其是由一个70个残基组成的同源片段,该区的另外四个氨基酸(Thr115,ArgⅢ,Lys124,Ala114)是激活肌肉基因转录的关键因子。Myf-5对骨骼肌发生起重要的调节作用,可激活肌肉的基因转录,抑制细胞生长周期,促进细胞分化。成肌调节因子的4个成员在骨骼肌发育过程中具有时空表达规律,其中MyoD与Myf-5主要在肌肉前体细胞分化为成肌细胞过程中起作用,而Myogenin与MRF4主要在成肌细胞向终末骨骼肌肌纤维分化过程中起作用。3.1mdv系统机制过去大量研究已经发现,生肌调节因子具有调节肌肉蛋白表达的作用,生肌调节因子对于肌肉表达的调控点在于能够很快激活肌肉特异基因的双向转录。MRFs所包含的四个成员都有同源性的bHLH(碱性-螺旋-环-螺旋)调节序列,其中HLH是二聚体形成区,碱性区是结合DNA转录区;首先对于含E盒的肌肉特异基因,Myf-5成员与E47和E12结合形成异二聚体,形成异寡聚物复合体,再结合到DNA序列CANNTG(E盒)上;Myf-5对于缺乏E盒的肌肉基因,必需通过激活MEF-2中间因子,转录激活这些肌肉基因的表达,促使其与肌肉特异基因的启动因子相结合;此外,Myf-5在成肌细胞分化和增殖过程中扮演重要的角色,可能预示着这些转录因子参与肌纤维生长而引起卫星细胞的分化和激活,卫星细胞的分化、融合、增殖是损伤后修复、持续负荷引发肌纤维肥大所不可替代的,所以Myf-5可能参与调节肌纤维的生长。前期研究还认为,信号链中第一个信使是各种激素、转录因子和其他调节蛋白被激活,从而通过这些蛋白调节基因表达来定量、定性地改变肌肉纤维比例的构成,进而推断出Myf-5调节蛋白的机理机制。3.2不同频率对我f-5蛋白表达的影响大量研究表明,废用状态下肌肉蛋白下降的主要原因是蛋白质合成率降低而分解率增加,因而导致机体肌肉蛋白质总量的减少,这是导致骨骼肌废用性萎缩可能的直接原因,生肌调节因子Myf-5是与骨骼肌的生成有重要关系的因子。振动刺激作为一种新的力量训练方法,对肌肉做功能力和力量的提升有长期持续和快速形成的良好作用,振动刺激强度采用不同的试验频率,可能得到不同的效果。根据表2和图1可知,D组Myf-5表达水平明显下降。D组与其余4组相比差异显著(P<0.05),B组和C组Myf-5蛋白表达水平明显上升,其中B组与A组间差异非常显著(P<0.01),B组与C组之间差异显著(P<0.05),C组与A组间有显著性差异(P<0.05)。表明自然恢复组(E)和振动刺激组(B、C)跟悬吊组(D)相比,myogenin都有从低到高恢复的趋势。并且其中的低频刺激组(B)比高频刺激组(C)的myogenin增加得较多,已经明显超过正常对照组,而低频刺激组增加得相对较少。自然恢复组(E)未达到正常对照组水平。悬吊组(D)最低,较正常对照组(A)明显下降。因此,该实验的研究结果支持预期的研究假设,说明振动刺激对于提高废用性肌萎缩的康复训练效果有积极作用。3.3悬吊对小鼠骨骼肌蛋白代谢的影响肌肉萎缩、废用状态下骨骼肌内部最明显的变化就是蛋白表达的减少,表现为Myf-5表达的急剧减少,前人研究已经从肌肉湿重、肌纤维横截面积以及肌纤维类型的改变等形态学方面证实了振动刺激对抗废用性肌萎缩是安全可靠且有效的。Myf-5是骨骼肌细胞增殖、分化的正性调控因子,对骨骼肌再生、转型、生长中起着非常重要作用。依据表3实验结果可以看出,悬吊14天后,D组Myf-5蛋白表达水平明显下降,较正常对照组下降了15.57%,并且D组与另外4组相比差异都很显著,说明悬吊引起的腓肠肌肌萎缩和Myf-5表达减少有重要关系,也许正是因为Myf-5表达水平的下降,导致肌蛋白合成速度减慢、合成率减少,于是造成了骨骼肌的萎缩;与之相反,给予不同频率的振动刺激之后,B、C组Myf-5表达水平明显上升,B、C组较正常对照A组分别上升了22.54%、9.19%,说明给予不同频率的振动刺激均可促使Myf-5蛋白表达水平升高,加速骨骼肌萎缩的恢复过程,其中B组较正常对照A组有非常显著性差异(P<0.01),B组与C组差异不大,C组与正常对照A组间有显著性差异(P<0.05)。说明较低频率的20Hz振动刺激较较高频率30Hz会更加快速提升骨骼肌中Myf-5蛋白的表达水平,促进肌蛋白合成,而自然恢复E组Myf-5的蛋白表达较D组则没有明显升高、变化,与正常对照A组相比仍然有显著差异(P<0.05)。总结大量研究文献说明在骨骼肌萎缩、废用时,早期便会出现与蛋白合成相关的分子表达改变,即萎缩、废用状态下骨骼肌蛋白质代谢的主要表现为:蛋白表达能力下降,蛋白质合成率降低,而分解率增加。本研究表明振动刺激能够有效对抗来自悬吊导致的大鼠腓肠肌废用性萎缩,振动刺激可以促使肌纤维类型由Ⅰ型向Ⅱ型的转化,并且促进其Ⅰ