几种常用抗原的制备方法

几种常用抗原的制备一、脂多糖抗原制备（一） 粗制LPS制备，参见第六章（二） 精制LPS制备1、 粗制LPS经3倍95%酒精，37°C水浴作用15分钟；离心后，沉淀物以蒸馏水配成3%溶液。2、 超速离心100000Xg4小时。上层为上清液，中间层为沉淀的LPS胶体，下层为粘液样沉淀物。3、 吸弃上清，小心取出沉淀物的LPS胶体（中间层）。4、 将LPS溶解在原体积的1/2蒸馏水中，再离心一次。5、 沉淀的LPS溶液于少量DW中，冻干保存。超离后分层情况（三） 多糖抗原制备：1、 将LPS200mg溶解在20ml1%醋酸溶液中，以移入带塞的试管中。2、 100C水浴30分钟。3、 5000Xg离心沉淀类脂，吸取上部液体，装入透析袋中，4C透析48小时。4、 冻干提取的多糖，产量为LPS的30——、40%。成功范例：沙门氏菌A—F群LPS提取。二沙门氏菌鞭毛抗原的制备1、将半固体培养基筛选活泼动力的单相沙门氏菌血清型接种到10mlM肉汤中，37°C16小时。2、 再移种到500mlM肉汤中，37C16小时。3、 400ur/m离心30分钟，收集细菌。4、 以适量生理盐水悬浮菌泥，并用1N盐酸调至PH7.0,室温轻度振荡30分钟.5、 1000r/m30分钟.上清中含有大量脱落下来的鞭毛素.6、 以1NnaOH将上清调至PH7.2.缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，达67%饱和硫酸铵浓度后,4C过夜.8次日将上清以15000r/m4C离心20分钟。9、 将沉淀物溶解于2ml蒸馏水中。10、过SephacrylS300层析柱（2.0X50cm），用Tris—HCL缓冲液洗脱，流速20ml/小时，收集第一峰，测定蛋白质浓度，分装保存。若对提纯要求不高，可以省略此步。11、 提纯鞭毛素的质量鉴定（1） SDS—PAGE：在非降解和降解条件下于10%凝胶SDS——PAGE垂直板上电泳（KB—2301电泳仪），恒流，25Ma/板，10C电泳5小时。（2） 凝胶用三氯醋酸溶液固定过夜色。用考马斯亮兰G—250染色。（3） 计算蛋白带分子量：Ha50000，Hb53000，Hd46000。12提纯鞭毛素的等电点测定一IEF取60ul样品溶解在9M脲和1%2—巯基乙醇中。上样于含有2%Ampholin(PH3.5—9.5)(LKBBromma，Sweden)和6M脲的4%聚丙烯酰胺凝胶(用22.2%聚丙烯酰胺和1.4%双甲丙叉烯酰胺原液配制)。蛋白质在LKB1117—003多功能电泳仪上，恒流4mA待电聚焦至电压250—300V。电泳5小时后，用10%三氯醋酸固定凝胶，经40%乙醇洗涤后，用0.1%考马斯亮兰G250染色过夜，再用14%醋酸脱色.确定PH梯度凝胶，从阳极端切成0.5cm长度，分别装入小试管内，加去离子水1小时后，用酸度计或PH试纸测PH值，划出PH梯度斜线,并确定样品的等电点・(Ha5.1,Hb5.1Hd4.9)。三、 粘附素抗原的制备(一) K88、K99和K987p的制备1、 将G—7或E68、C83907和UP001在37°C培养16—20小时。2、 从克氏瓶中洗下，用0.1MPBS(PH7.0)悬浮。3、 62C水浴振荡20分钟使粘附素脱落。4、 8000r/m20分钟，其上清液用10%乙酸调PH至4.5,4C放置过夜，使K88粘附素沉淀(等电点沉淀)。5、 以8000r/m离心，将沉淀物用0.1MPBS溶解。6、 经SephadexG200柱层析(2.6X80cm)纯化，用0.01MPBS(PH7.0)作为平衡液及洗脱液，流速为1ml/分.7、 收集第1峰,合并前半峰即为纯化K88抗原・。8、 测定蛋白质浓度，小量分装，一30°C保存备用。（二） K99抗原的制备1、 K994529在Minca培养基上37C培养18小时。2、 磷酸盐尿素缓冲液洗下菌细胞。3、 60C加热孵化20分钟，离心后去菌体,上清加60%饱和硫铵，4C搅拌2小时。4、 离心收集沉淀，悬浮沉淀对上述缓冲液透析16小时。5、 进一步经SephadexCL—4B柱层析纯化，浓缩后再经SephadexG—50脱盐。（三） 987P抗原的制备1、 C88710Slane培养基37C20小时培养。2、 生理盐水洗下菌笞，离心收集菌体。3、 菌泥中加入400ml含2M尿素0.01MPBS,60——63C1—1.2小时。4、 60%饱和度硫酸铵沉淀离心上清。5、 离心后，沉淀物再过Sepharose4B柱。6、 收集第一峰前半峰，浓缩后经SephadexG50脱盐。（四） F48抗原的制备1、 C95707、C85919和B41M分别接种Minca培养基上，37C18小时。

2、 灭菌0.05MPH7.2PB收集菌体。3、 62°C水浴加热处理1小时，并不时振动，离心去菌体。4、 上清置4C72小时，等电点4.6沉淀法使粘附素沉淀•5、 离心后，将沉淀于SeparoseCL—4B纯化，以含2M尿素0.05MPH7.2PBS洗脱，洗脱液浓缩后再脱盐。附：各种粘附素等电点。TOC\o"1-5"\h\zK88 4.2K99 9.7987P 3.7F41 4.6四、 全菌抗原的制备1、 丙酮灭活菌制备参见前述。2、甲醛灭活全菌制备：以0.4—0。6%甲醛生理盐水与新鲜肉汤培养物等体积混灭菌，经PBS洗涤后，配成1—10X10（6）/ml,4C保存备用。3、 热灭活全菌制备：将鲜培养物以DW稀释至10亿/ml细菌，100C水浴2小时，离心吸取上清（另一种抗菌原），菌泥进一步用PBS洗3次，保存备用。4、 酒精灭洗全菌制备。五、 病毒抗原的制备（一）鸡新城疫病毒提纯—“层析法”1、1、鸡红细胞吸附释放法。鸡红细胞吸附表面有一种糖蛋白受体，在4°C时，病毒被吸附到红细胞膜的受体上，但在37C时病毒的N—乙酰神经氨酶破坏受体的糖苷键后，病毒又可以从红细胞膜上释放。操作步骤如下：感染病毒的鸡胚囊液，在4C下6000r/m,30分钟，弃沉淀。上清液根据病毒血凝滴度的高低，加入1—3%的新鲜洗涤的鸡红细胞，在4C下吸附1—2小时。3000r/m0分钟，弃去上清。吸附有病毒的红细胞重悬浮于1X钙盐水中(含4%CaCL2的生理盐水)，在37C下放置2—4小时。(5) 3000r/m20分钟取上清。28000r/m小时，沉淀重悬于小容积的生理盐水中，即为初步纯化病毒。2、 解脱后的病毒蛋白液再上SepadexG—200柱，以PBS洗脱,收集第1峰。即为进一步纯化的NDV。(二)NDV纯化—离心法1、 NDV种毒以灭菌生理盐水作1：100稀释，再接9—11日龄SPF鸡胚的绒毛尿囊腔内(0.1—0.2ml/胚)。2、 37C孵化，每天照蛋两次，收获24—96小时死亡鸡胚的澄清无菌之尿囊液，测血凝价，分装一30C保存备用。3、 尿囊液经5000Xg30分钟。4、 取上清102732Xg离心30分钟。5、再取上清用20%蔗糖垫底，110000Xg离心2.5小时5、6、 取沉淀用少量PBS悬浮，经10—60%蔗糖等到密度性梯度离心，91000Xg 16小时（BecKman，L7，SW28）。7、 收集含病毒的蔗糖区带。8、 用PBS稀释上清，110000Xg离心2.5小时。用小量PBS悬浮沉降病毒，小量分装，一70°C保存备用。（三）NDVHNNPF蛋白制备一SDS—PAGE。附：聚乙二醇法浓缩病毒在病毒悬液中加入一定量的PEG6000。在此条件下，病毒可随其他大分子物质发生沉淀。操作步骤如下：（1） 收获经病毒感染的尿囊液，6000r/m30分钟，弃沉淀。（2） 上清液中加入7.5%的PEG和0.1—00.4MnaCL，4C下放置2—4小时。（3） 6000r/m30分钟，收集絮状沉淀物，重悬于小容量的缓冲液内。六、 MDV羽囊琼扩抗原制备，从略。七、 IBDV琼扩抗原制备，从略。八、 转铁蛋白制备：利凡诺—低温乙醇分级沉淀法。1000ml血浆加与血浆等到体积的2.0%利凡诺（内含1%Na2CO370ml），边加边搅拌产生黄色粘性沉淀物（为白蛋白）校正上清PH8.1—8.2，静置3—4小时白蛋白沉淀）弃收集上清液加1%活性吸附利凡诺（20分钟）抽滤，得澄清滤液移入一10°C冷冻用1MHac调PH7.0—7.2加乙醇终浓度为25%（乙醇要用Hac调PH7.0—7.2）校正PH7.0—7.2—60—70C放2小时—4C离心20分钟（20000r/m）球蛋白沉淀）弃上清冷至一8C（调PH5.80+（-）0.05）加乙醇至终浓度40%调PH5.8+（—）0.05—10C放置沉淀过夜—4C离心，收微红色沉淀（转铁蛋白）沉淀溶于5—10倍无热