中药生物技术-复习

绪论生物技术：应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术生物工程（Bioengineering）：是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的科学原理，按照预先的设计，改造生物体或加工生物原料，为人类生产所需产品或达到某种目的一门高技术学科。中药生物技术（BiotechnologyofChineseTraditionalMedicine）：是以植物学、动物学、微生物学、生物化学、天然产物化学等现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它学科的科学原理，针对中药和天然药物及其活性成分研究、开发和生产中存在的具体问题，按照预先的设计，进行生物体改造或生物原料加工，使其符合中药现代化和产业化要求的一门科学技术生物组合化学：将具有明确生物活性的天然化合物或活性组分，在具有多种催化作用的微生物、植物组织或酶的作用下转化成为新的组合型天然化合物群/库，再通过药理筛选手段寻找新的高活性或低毒性的天然活性先导化合物，并对活性化合物体内外生物转化情况进行考察，改善药物体内生物利用度及发现活性化合物的活性中心的一门新型交叉学科多基因病：疾病的发生和发展是多基因或多通路间平衡失调的结果，疾病基因组学的研究已突破了以往一个基因一种病的思维模式。如癌症基因，约数百个；疾病相关基因的网络：利用生物大分子相互作用和网络调控的思维模式来研究和分析疾病基因的作用；基因组的多样性和进化规律：研究群体和个体在生物学形态以及在对疾病的易感性／抗性上的基因差异；基因组的表达和调控：研究群体和个体在整个生长发育过程或反应通路的基因表达网络机制，如一方面大多数细胞中基因的产物都要与其他基因产物相互作用，另一方面在发育过程中大多数基因产物都在多时间和空间表达并发挥其功能，形成基因表达的多效性。中药生物技术的主要研究内容？基因工程（geneengineering）：生物体的遗传性状都是由基因决定的，而基因的物质基础是DNA。基因工程是一种通过对基因的重组、转移、定位等方法人为改变生物的形态和功能的工程。细胞工程（cellengineering）是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内容包括:细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。发酵工程（fermentationengineering）：传统上发酵工程是指利用微生物的作用并通过近代工程技术来实现有用物质的工业化生产或其他产业过程的技术体系。目前，随着生物技术的发展，利用植物细胞、动物细胞及DNA重组技术改造的微生物来进行工业化生产的过程也列入现代发酵工程的范畴。酶工程（enzymeengineering）：酶是具有特异催化功能的蛋白质，利用酶的催化作用进行物质的生物合成/生物转化来生产有用物质的技术，称为酶工程。蛋白质工程（proteinengineering）：蛋白质是生命活动的体现者。蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学、生物信息学的研究获得关于蛋白质物理、化学等各方面的信息，并在此基础上对通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终实现产业化的技术过程生物技术相关学科与中药现代化的关系1细胞和分子生物学与中医药的关系：细胞和分子生物学是基础医药学各学科间联系的纽带2基因组学与中医药的关系：基因组学主要包括：疾病基因组学：主要研究定位克隆、多基因病、疾病相关基因的网络概念；功能基因组学：从生物学整体观的角度出发，研究基因组的多样性和进化规律，基因组的表达和调控，模式生物体基因组研究等研究思路，都与中医药理论中整体观念、辨证施治、阴阳学说等有许多相似之处，这为中医药现代化研究提供了契机。如能将中医药基本理论主动地应用于基因组学的研究思路，将中医药基本理论与基因组学研究方法和理论相比较、相交融，将会使中医药学在未来医学和生物学中占有重要地位，同时也可为中医药现代研究跨越式的发展提供崭新的研究思路和方法。未来的基因组和后基因组学研究将把医疗保健带入一个崭新的时代：„医疗方面，将由目前主要是依赖经验转向以特异的分子病理学为依据；治疗方面，不断地把患病后高成本、低疗效的治疗转变为以患病前预测疾病为依据的预防式治疗(未病先防)。上述“以人为本”、“预防为主”的医学模式与中医辨证施治的诊治模式不谋而合。如能将中医证候诊断与现代的基因诊断相结合；把证候诊断观察到的表观现象与基因诊断发现的疾病发病基因相关联；不论对研究功能基因组学、疾病基因组学、蛋白组学中相关基因组或蛋白组的异常表达，还是研究中医证候外观表象的内在发病机制，均有着极为重要的意义，两者的有机结合将达到双赢的结果3整体生物学、宏观生物学与中医药的关系：整体生物学（integrativebiology）是在有机体整体水平上研究生物的结构、功能和生命活动过程，进而解释从细胞、组织直至生态系统的生命现象。它是后基因组学研究的更高层次。宏观生物学（macrobiology）是以种群、群落、生态系统及全球系统的生命现象为研究对象，涉及动物-植物相互作用关系、生物多样性、进化与系统发育、生物超微结构与功能形态学、生物通信等研究领域。生命科学研究领域将向微观和宏观两个方向发展。鉴于医学模式已经由以往的“生物医学”向“生物-心理-社会医学”转变，由单纯的疾病治疗转变为预防、保健、治疗、康复相结合的模式，宏观生物学必将引起医药相关领域的深刻变革。将中医药理论思想与现代宏观生物学的学术思想交互融合，符合中医药现代化的内涵并有助于其国际化进程。4现代生物技术与中药学的关系简述中药生物技术发展前景1中医药基础研究将更加借助于生命科学技术手段2生物技术将使原始的中药农业步入现代经济农业产业的轨道3细胞和酶工程技术将使名贵濒危中药材及其活性成分的生产实现产业化4生物技术将贯穿到中药新药研制的全过程植物基因工程基因（gene）（question）定义1：有遗传功能的DNA/核苷酸片段。定义2：存在于细胞内有自体复制能力的遗传物质单位。定义3：遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸转录因子（Transcriptionfactors，TFs)：转录因子（transcriptionfactor）是一群能与基因5’端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。根据转录因子的作用特点可分为两类；第一类为普遍转录因子,它们与RNA聚合酶II共同组成转录起始复合体，转录才能在正确位置开始。TFIID以外，还发现TFIIA，TFIIF，TFIIE，TFIIH等，它们在转录起始复合体组装的不同阶段起作用。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素、生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。一次代谢及一次代谢产物：糖、蛋白质、脂质、核酸等是对植物机体生命活动必不可少的物质，称为一次代谢产物，也称为初级代谢产物；上述物质产生过程对维持植物生命活动来说是必不可少的过程，且几乎存在于所有的绿色植物中，此过程称为一次代谢，也称为初级代谢。二次代谢及二次代谢产物（Question）：特定条件下，一次代谢产物作为原料或前体，又进一步经历不同的代谢过程，这一过程并非在所有植物中都发生，对维持植物生命活动亦不起重要作用，此过程称为二次代谢，也称为次生代谢；生成的萜类、生物碱等化合物称为二次代谢产物，也称为次生代谢产物。代谢组学：旨在研究某个生物体或某个组织甚至单细胞的全部代谢物及其动态变化。就当前的仪器分析水平而言，这是一个无法完成的任务，而次生代谢产物的存在使得植物代谢成分高通量全面(comprehensive)分析更加困难。因此，有学者提出代谢组学应当重新定义，应当对特定条件下代谢表型(metabolicphenotypes)，以及这些表型与基因型之间的联系的研究。抗病毒植物基因工程：是利用植物基因工程的方法，将抗性基因转入植物体内，使植物获得遗传保护功能，它为防治病毒提供了一条新的途径。外壳蛋白：（coatprotein,CP）是一种存在于绝大多数病毒中的结构蛋白，也是病毒中含量最多的一种蛋白。病毒感染植物后首先在植物细胞内脱外壳，因此在病毒感染早期，被侵染细胞内存在很多游离的外壳蛋白。目的基因转入植物的方法„1利用农杆菌的Ti质粒进行转化土壤农杆菌介导的基因转移是目前最常用的获得转基因植物的方法。优点：不需要分离原生质体，操作简单、方便；植物细胞再生效率高；外源基因拷贝数较低，大多为单拷贝转移，外源基因转入并整合到植物基因组中后不被修饰改变。缺点：难以转化大多数单子叶植物。„2利用病毒感染进行转化病毒载体的优点：比较小，故易于实验室操作；不受单子叶或双子叶限制缺点：病毒所载的外源基因易被排斥出来或被消灭；病毒插入外源基因后容易丧失感染力；寄主范围窄。„3物理转化方法1基因枪法：通过基因枪技术，很多植物都可以得到转化，故此方法是最有前途的植物DNA转移系统之一。缺点：使用此法时，外源基因整合到植物细胞基因组上的效率极低。2电击法/电脉冲法3激光微束穿孔法4显微注射法5脂质体介导法6多聚物介导法7花粉管通道法：该技术操作简单，而且能避免体细胞变异等问题，因此有一定的使用价值和应用前景。植物基因工程的主要内容：„（1）从种类繁多的植物基因群中分离目的基因；„（2）寻找或构建克隆载体；„（3）重组载体导入植物细胞，并整合至其基因组上；„（4）重组载体的植物细胞再生成正常植株；„（5）再生植株通过有性过程，将外源基因传递给后代。利用农杆菌的Ti质粒得到转基因植物的主要转化步骤?目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。Ti质粒的特点该质粒上有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA），其长度在12-24kb之间，它能转移并整合到植物基因中并导致冠瘿瘤的形成。DNA区域上有三个基因组：tms，tmr和tmt，分别编码合成植物生长素、分裂素和生物碱的酶系。生长素与细胞分裂素的大量合成导致植物冠瘿瘤的生长，因此tms和tmr基因被称为致瘤基因（onco-genes）。tmt基因编码冠瘿碱合成酶，这种酶能催化一个氨基酸分子或一个酮酸分子与一个糖分子缩合成冠瘿碱，冠瘿碱可以为土壤农杆菌的生长提供碳源和氮源。）Ti质粒上与植物感染和致瘤有关的另一个重要部分是vir基因，该基因组大约35kb，其编码产物作为反式蛋白因子促进植物细胞的转化。vir区基因对T-DNA的转移是必需的，但不与T-DNA直接相连。Vir表达产物诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链线性拷贝。该单链T-DNA从Ti质粒脱离后在vir基因表达产物（如VirD2蛋白等）的引导下穿过农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、植物细胞壁、细胞模及核模，最后整合到植物细胞的染色体中。Ti质粒用于植物基因转化的主要方法?（1）原生质体共培养法：用农杆菌转化已再生细胞壁的原生质体，通过选择获得再生植株。这种方法需要有效的原生质体再生方法，故实用范围有限。（2）叶盘法：将叶片或其它组织切割成段或用打孔器打成直径为1-1.5cm的圆盘，浸入土壤农杆菌培养液中几钟，将组织表面多余的菌液吸去，然后置于合适的培养基上培养。外植体在培养基上与农杆菌共培养（2d以上），选择转化植株。转化植物细胞的选择与转基因植株的鉴定1转化植物细胞的选择：目前对转化细胞的选择主要是利用标记基因来进行，最常用的标记基因为抗生素抗性基因，如抗卡那霉素（kanamycin）抗性基因，即NPTII(neomycinphosphtransferaseII：新霉素磷酸转移酶II)基因，可用于许多双子叶植物的转化细胞，如烟草、番茄、马铃薯等，有些植物对卡那霉素不敏感，可选择另外一些抗生素如MTX（methotrexate,甲氨蝶呤）或HYG（hygromycin,潮霉素）等。2胭脂碱合成酶基因鉴定：胭脂碱合成酶基因是土壤农杆菌Ti质粒上的一个基因，其表达产物胭脂碱合成酶能催化生成胭脂碱（nopaline），后者经一定操作后可在紫外光下直接检测。将经过选择的转化细胞所形成的愈伤组织或植株取一部分，经过纸层析，在紫外光下直接检测胭脂碱合成酶基因表达后的生成物，即可对植株进行鉴定。3报告基因鉴定：1大肠杆菌的GUS基因：将无色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖醛酸水解，产生蓝色的水解产物2CAT（氯霉素乙酰转移酶）基因：用转化的植物、植物细胞或愈伤组织提取物与14C标记的氯霉素及乙酰辅酶A进行反应，然后测定有多少氯霉素被乙酰化3荧光素酶基：转化过的植物细胞与荧光素、ATP混合，荧光素酶可催化荧光素的氧化反应，生成AMP、CO2和光，利用胶片感光的方法进行检测和示踪4绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）基因：表达产物为238个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白性质极其稳定，而在高温、紫外光激发下发绿色荧光（最大吸收峰为395nm）植物细胞结构的主要特征是什么?1、细胞壁.主要成分为纤维素和果胶.由三部分组成：包间层、初生壁、次生壁.功能：维持细胞的形状,防止水分损失.2、叶绿体.双层膜、含有叶绿素,能进行光合作用.3、液泡.单层膜,液体中主要成分为水.功能：贮存物质（糖类、蛋白质、色素等）、调节细胞内环境.植物次生代谢途径基因修饰的主要策略是什么导入单个、多个靶基因或一个完整的代谢途径，使宿主植物合成目标产物的含量大大提高（如青蒿酸）或生成新的目标物质；（2）通过反义RNA和RNA干涉等技术减少靶基因的表达，从而抑制竞争性代谢途径，改变代谢流向和增加目标物质的含量；（3）对控制多个生物合成基因的转录因子进行修饰，更有效的调控植物次生代谢以提高特定化合物的积累。目前，在基因水平上研究的最清楚的植物次生代谢途径是合成黄酮类及花青素的次生代谢途径。在中间产物和酶水平上对其他次生代谢途径所进行的详细研究已经鉴定了许多具有重要医药价值的次生代谢产物，如吲哚和异喹啉生物碱等。抗病虫害中药材基因工程的主要优点是什么（1）化学或生物杀虫剂在一个生长季节通常需喷洒6-8次，而抗虫品种一旦培育成功就可能获得对害虫的连续抗性，在植物整个生长周期都有保护作用，故成本低；（2）保护作用遍及全株，故可使化学或生物杀虫剂很难接触的部位（如根部）受到保护；（3）抗虫基因存在于植物体内，扩散的可能性很小，因此安全性好；（4）多数抗虫基因具有很强的特异性，只杀死摄食害虫，而对其它生物没有影响。药用植物细胞工程技术细胞工程（cellengineering）定义1（广义）：细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术；定义2（狭义）：细胞工程是指细胞融合和细胞培养技术植物细胞的全能性：植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。原因（基础）：生物体的每一个细胞都含有发育成为完整个体所必需的全部基因植物组织培养（planttissueculture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花、果实等）、组织（如花药组织、形成层、胚珠、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞、花粉等）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件（含有营养物质和植物生长调节物质等），使其生长发育的技术。外植体：在组织培养中，我们把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分无菌的组织或器官叫做外植体。继代培养：“第一代培养”：第一代培养是指由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代进间而称之为“第一代培养”。第一代以后的培养就称之为继代培培养基：人工配制的适合于不同生物体生长、繁殖、代谢和合成所需产物的营养物质和原料。维管组织(vasculartissue)：由木质部和韧皮部组成的输导水分和营养物质，并有一定支持功能的植物组织。为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成不同的组织、器官？基因在特定空间及时间条件下选择性表达的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。植物细胞工程的主要研究内容。原理：细胞全能性的本质；细胞分化机理；代谢途径的调控；培养细胞生理和遗传的变异；不亲和性机制；细胞大规模培养动力学参数的建立技术：细胞和组织培养方法的改进；细胞器的分离和引入；原生质体融合、杂种培养筛选和鉴定；培养细胞中有用成分的鉴别、分离和分析；试管苗的大规模植物组织培养的基本过程。发展历程1探索阶段（从20世纪初到30年代中）：Haberlandt:贡献：提出细胞全能性假说；首次进行离体细胞培养2奠基阶段(20世纪30年代中-50年代中)：1952：Morel和Martin首次报道茎尖的离体培养，获得无毒大丽花植株1952-1953：Steward用胡萝卜根细胞悬浮培养，发现单细胞能像受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植株，证实了植物细胞全能性学说。1954：Muir成功培养烟草单细胞3蓬勃发展阶段（20世纪50年代末以来）原生质体培养取得重大突破：1971年，首次由烟草原生质体获得了再生植；花药培养取得显著成绩：1967年，通过花药培养获得了完整的烟草植；微繁技术得到广泛应用植物组织培养的应用1在植物脱毒和快速繁殖上的应用2植物育种上的应用：（1）单倍体育种（2）胚胎培养（3）细胞融合（4）基因工程遗传操作（5）培养细胞突变体3在植物有用产物上的应用4在植物种质资源保存和交换上的应用：人工种子；低温保存5在遗传、生理、生化和病理研究上的不同植物类群诱导愈伤组织的易难顺序？细胞核已开始解体的筛管和木质部成分，或细胞壁厚于2µm的植物纤维细胞(成熟的管胞壁厚达7µm)不再具有分裂能力。灭菌剂最常用的灭菌剂次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。次氯酸钙多用市售工业用漂白粉，因有效氯含量不稳定，故常用其过滤后的过饱和溶液。该溶液特别适用于草本植物和柔软组织的灭菌处理，灭菌时间一般为5~30min。氯化汞灭菌效果最好，但去除也最困难，且灭菌时间不宜过长，以免损伤或杀死植物细胞。氯化汞作为休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为0.1%，用于有较厚种皮的休眠种，灭菌时间一般为2～10min。培养基1培养基营养物质组成的化学成分：(1)合成培养基：化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，适用于各种生长指标的测定。但微生物生长较慢，而植物细胞生长良好。如MS（MurashigeandSkoog）培养基等。(2)半合成培养基：在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。(3)天然培养基：由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用作为微生物的培养基。2培养基的物理形态：液体培养基：液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，生物体能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，常用于发酵工业。固体培养基：在液态培养基中加入凝固剂，如琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于诱导植物细胞愈伤组织，生物体分离、鉴定、计数和细胞株保存等方面。(3)半固体培养基：是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。3培养基的用途：增殖培养基：根据某种生物体生长的需要，在培养基中加入有利于该种生物体生长、繁殖的营养物质，以提高对这种生物体的分离效率。选择培养基：在培养基中添加某些对所需要的生物体没有影响而对其它生物体具有抑制作用的物质，使所需要的生物体生长良好，这种培养基对某种生物体具有严格的选择性，称为选择培养基。鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂，使不易区分的生物体经过培养后，由于代谢的不同而对指示剂的反应呈现明显的差异，有助于鉴别不同生物体的培养基。愈伤组织的形成过程1诱导期：外植体细胞进行分裂准备的时期。此间，外植体细胞大小虽然没有明显变化，但细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。2分裂期：外植体外层细胞开始迅速分裂。在此时期，由于细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速度，故细胞体积迅速变小，逐渐回复到分生状态。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，RNA含量最高时，标志着细胞分裂进入了高峰期。3形成期：外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织时期。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，细胞的分裂由原来局限在组织外源的平周分裂转为组织内部较深层局部的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织（meristemoid)，称为分生组织结节。获得优良愈伤组织的策略1选择适当的基因型和适当的外植体•同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同•同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同2选择正确的培养基•正确的植物激素的种类、浓度以及在需要配合使用生长素和细胞分裂素时，二者之间的配比。3采用某些特殊的理化因素改变诱导培养基和培养条件•如：玉米幼胚愈伤组织培养，添加5mg/L或10mg/LAgNO3以抑制组织内乙烯，从而使愈伤组织的频率由对照的4.9%分别提高到26.9%和34.0%影响维管组织分化的因子有哪些？1生长素：含有蔗糖和生长素的琼脂能有效地取代芽的作用，同样能够诱导维管组织的分化。2蔗糖：浓度：当培养基中含有低浓度生长素时，通过改变蔗糖浓度，即可改变洋丁香和菜豆愈伤组织块中所形成的木质部和韧部的相对数量。1％蔗糖，形成少量的木质部分子2％蔗糖，有利于木质部的形成2.5％~3.5％蔗糖，木质部和韧皮部都能分化种类：除了蔗糖之外，属于二糖的麦芽糖和海藻糖也能刺激菜豆愈伤组织导管的分化。葡萄糖、果糖和其他单糖则无刺激作用3细胞分裂素和赤霉素对维管组织分化的作用与物种有关。4物理因子：。在向日葵中，温度若低于17℃，导管分子不能分化，在17~31℃的范围内，木质部的形成随温度的增加而增加。另外，光对洋紫苏创伤导管的分化有刺激作用烟草表皮细胞及冠瘿瘤细胞如何表现出全能当由正在开花的烟草植株的茎撕取薄层表皮进行培养时，它们所形成的芽的类型因茎的取材区域而不同。在一定的培养条件下，由花枝撕取下来的薄层表皮只能产生花芽，由植株基部撕取下来的薄层细胞只能产生营养芽，由中间部分取得的外植体能产生这两种类型的芽，但其间的比例会有不同，这取决于它们与植株基部距离的远近。只有当培养基中所含的激动素和IAA的浓度皆为10-6mol/L，且蔗糖为2％~3％时，烟草花枝的表皮才能形成花芽。若不改变IAA浓度，但把激动素浓度提高到10-5mol／L，则会完全抑制花芽的形成，而出现营养芽。若进一步改变这两种激素在培养基中的平衡关系，还有可能使形态发生过程转变为有利于生根或形成愈伤组织。冠瘿瘤细胞的全能性在某些植物中，根瘤农杆菌(Argobacteriumtumefaciens)能诱发一种特殊类型的瘤，称做畸胎瘤。畸胎瘤细胞在寄主组织中或在无限期的培养中表现出一种十分显著的分化茎芽和叶片的能力。只是由这些细胞形成的茎在形态上和生长方式上都是异常的。然而Braun和wood证明，在烟草中由畸胎瘤也可以产生完全正常茎。建立了单细胞组织无性系→切取小块组织，嫁接到已经去掉了腋芽的健康烟草茎的切口上→瘤组织长出了一些高度异常的茎芽→把由嫁接得到的畸胎瘤的茎尖(3—5mm长)切下来，再嫁接到另一个健康植株上→重复嫁接，最终得到旺盛生长如何证明生长素在维管组织分化中的作用?药用植物细胞、原生质体培养技术条件培养基：把培养了4~6周的高密度细胞滤掉，而用它的培养基制成悬滴或薄层来培养单细胞或低密度细胞群体。悬浮培养：是指一种在受到不断摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的培养系统。原生质体：除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体单细胞的分离1由完整的植物器官分离单细胞：机械法:①刀片刮叶片法②研磨、离心法（只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。）1.细胞不受到酶的伤害；2.不用质壁分离；3.细胞产量低；4.细胞易破酶解法：用于分离细胞的果胶酶不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。因此，在用酶解法分离细胞的时候，必须对细胞给予渗透压保护。如果所用的甘露醇的浓度低于0.3mol/L，烟草原生质体将会在细胞壁内崩解。在有些物种中，特别是在大麦、小麦和玉米中，很难通过酶解法使细胞分离。在这些禾谷类植物中，由于叶肉细胞伸长，并在若干地方发生收缩，因而细胞间可能形成一种互锁结构，阻止了它们的分离。1.细胞受到酶的伤害；2.要质壁分离；3.细胞产量高；4.细胞不易破2由培养组织中分离：（1）诱导产生愈伤组织（2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散（3）Subculture将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流单细胞的培养方法有哪几种？各有什么特点？1平板培养法：注意事项：（1）当培养基凝固之后，细胞能均匀分布并固定在很薄一层(约lmm厚)培养基中；（2）用封口膜把培养皿封严；（3）置培养皿于倒置显微镜下观察，对其中的各个单细胞，在培养皿外的相应位置上用细记号笔做上标记，以保证以后能分离出纯单细胞无性系。一般来说，培养期间应避免频繁地在光下对培养物进行显微镜检，否则对细胞团的生长将会产生有害作用。因此镜检的次数越少越好。2看护培养法：主要特点是：把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间，有一片滤纸相隔。看护愈伤组织不仅给这个细胞提供了培养基中的营养成分，而且还提供了能促进细胞分裂的其他物质。3微室培养法：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。此法的优点是：在培养过程中可以连续进行显微观察，可把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程都记录下来。培养基的成分和初始植板细胞密度是单细胞培养成败的关健。为什么说初始植板细胞密度是单细胞培养成败的关健？有关细胞密度对细胞分裂的影响的解释是建立在“细胞能够合成某些对进行分裂所必需的化合物”的基础上。只有当这些化合物的内生浓度达到临界值以后，细胞才能进行分裂。而且，细胞在培养中会不断地把它们所合成的这些化合物散布到培养基中，直到这些化合物在细胞和培养基之间达到平衡时，这种散布过程方才停止。结果是，当细胞密度较高时达到平衡的时间比细胞密度较低时要早得多，因此在后一种情况下，延迟期就会延长。当细胞密度处于临界密度以下时，则无法达到此种平衡状态，因此，细胞也就不能分裂。然而，使用含有这些必需代谢产物的条件培养基，则能在相当低的细胞密度下使细胞发生分请解释什么叫条件培养基。条件培养基：把培养了4~6周的高密度细胞滤掉，而用它的培养基制成悬滴或薄层来培养单细胞或低密度细胞群体。看护培养物产生的代谢物扩散到低密度细胞培养基中以后，促进了细胞生长的活力。如何建立植物细胞悬浮培养体系？请简单介绍植物细胞悬浮培养的基本形式。一、分批培养：指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培养物。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。1滞后期细胞很少分裂，其时间长短取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。2指数生长期细胞分裂活跃，细胞数目迅速增加3直线生长期细胞生长和发育最快的时期4减慢期由于培养基中某些营养物质已经耗尽，或是由于有毒代谢产物的积累，细胞的增长逐渐减慢5静止期(stationaryphase)生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。二、连续培养是利用反应器进行大规模细胞培养的一种培养方式。封闭型连续培养：排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充，进出数量保持平衡。悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来之后，又被放回到培养系统中。因此，在这种“封闭型连续培养”中，随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。开放型连续培养：注入的新鲜培养液的容积与流出的原有培养液及其中细胞的容积相等，并通过调节流入与流出的速度，使培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的恒定水平上。三、半连续培养：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。半连续培养是一种具有定时进出装置的成批培养系统。每一天或两天时间间隔收获一部分培养物（最多可达50%），然后再加入新鲜培养基，通过调整收获细胞的数量和次数来保持细胞重量的恒定。悬浮细胞同步培养法1饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在Gl期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。2抑制法：使用DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶、羟基脲苷和胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能进行到G1期为止，细胞都滞留在G1期和S期的边界上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细胞周期。植物细胞培养有哪几方面的应用1突变体的选择正选择：把受选择的细胞群体置于一定的选择压下，从而使正常的细胞受到淘汰，而只有我们所需要的突变细胞才能生长的一种选择方法。正选择适宜于对抗性突变体的选择，如以除草剂为选择剂选择抗除草剂突变体。负选择的情况和正选择恰恰相反，在一项负选择实验中，选择的对象是在一定选择压的作用下不能生长的那些细胞，而能够生长的细胞受到淘汰。负选择适用于对营养缺陷突变体的选择。2天然化合物的生产和生物转化3诱导多倍性原生质体分离方法：机械分离法－先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可以释放出完整的原生质体。－优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。－缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。酶解分离法–常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等–优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。–缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的活力。原生质体的纯化A、过滤法B、漂浮法C、离心法简述分离原生质体的方法及步骤。例：烟草叶肉细胞原生质体的分离.材料的准备与消毒：.酶解：用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮，将叶片切成2cm长的小片，然后放入含酶溶液中处理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，温度25～28℃下经3-4小时的酶解反应，其间轻轻摇动培养皿若干次）。.纯化：将酶解悬浮液通过300-400目网，以除去大的未消化的碎片，然后将含有原生质体的酶液收集在离心管中，低速离心，使原生质体沉于管底，倾去上清液，在离心管中加入适量洗涤液，再离心；重复此步骤3次，使酶解液充分除去；最后用原生质体培养液离心一次.原生质体的活力：形态识别：形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大酚藏花红染色法（0.1%)–酚藏花红能使有活力的原生质体染成红色，无活力的原生质体不着色。伊凡蓝(Evan’sblue)染色法(0.025%)有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。荧光显微镜识别(FDA法)：FAD被酶解后在完整的活细胞内积累。在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。植物原生质体的培养法1固体培养法：原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培养基中。优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。缺点：培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右2浅层液体培养法：在培养皿或三角瓶中注入3~4ml原生质体培养液，然后将纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养优点：原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况3双层培养法：在固体培养基上，加入适宜原生质体胞壁再生和细胞分裂的液体培养基。优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。4琼脂糖珠培养：将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50µl一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育，这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。诱导原生质体融合的方法及融合剂◆生物法：病毒法缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。◆化学法：盐类融合法：–优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小–缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发高Ca2+和高pH值融合：–钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合；–高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合聚乙二醇（PEG）融合法（常用）：融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合。PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法◆物理法：电融法（常用）：优点：–对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。融合体的类型自体融合：发生在亲本原生质体自身•异体融合–谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源两倍体–部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，便发生少量染色体的重组，然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株–异胞质体细胞杂种：亲本的染色体全部被排斥，但胞质是双亲的–嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体•异体融合原生质体杂交后，杂种细胞的筛选方法有哪些？互补选择法(遗传或抗性)：—利用两个亲本具有不同遗传和生理特性,在特定培养条件下,只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法生长特性选择法：–利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞:生长速度快慢,再生植株的能力。物理特性选择法：–利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种,适合具有明显显微特征的融合体。其他方法：–如采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。荧光染料法：—两个亲本原生质体在融合前用的荧光染料进行染色。细胞分类器辨别和收集发两种但仪器价格昂贵，不常用。异硫氰酸荧光素（FITC）异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出绿色和红色发酵工程技术发酵：利用生物体(动物、植物、微生物）的生命活动，在有氧或无氧条件下制备生物体及其代谢产物的过程。发酵工程是现代生物技术的重要组成部分，是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机结合，利用生物体的代谢、转化功能，获得有用物质的工程技术。生物体培养基：人工配制的适合于不同生物体生长、繁殖、代谢和合成所需产物的营养物质和原料。灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。除菌(degermation):用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子防腐(antisepsis):用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖生物反应器：指利用生物催化剂进行生物技术产品生产的反应装置（或场所）。它不仅包括传统的发酵罐、酶反应器，还包括采用固定化技术后的固定化酶或固定化细胞反应器、动植物细胞反应器固态发酵(SolidStateFermentation):广义上是指一类使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程。既包括将固体悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有（或几乎没有）游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。但多数情况下固态发酵则是指在没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。发酵发展：1天然发酵阶段：公元前几千年----19世纪主要特点：厌气发酵，非纯种培养，以经验传授技术，产品质量不稳定。2纯培养技术建立阶段（19世纪中叶）：发酵本质的认识。证明发酵原理：发酵现象是微小生命体进行的化学反应纯种培养技术的建立：霉菌、细菌的纯培养。此阶段称为发酵工程的第一个里程碑，以微生物的纯种培养技术为主要特征。3通气搅拌发酵技术的建立阶段（20世纪初期）：通气搅拌解决了液体深层培养的供氧问题。无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计解决了耗氧发酵中的杂菌污染问题。此阶段称为发酵工程的第二个里程碑,以微生物液态深层发酵技术为主要特征。4生物体酶转化及代谢调控技术的应用（1950－1960）①其一是采用微生物进行甾体化合物的转化技术；②其二是以谷氨酸等发酵生产成功为代表的代谢控制发酵技术的出现此阶段称为发酵工程的第三个里程碑,以生物体酶转化及代谢调控技术为主要特征。5发酵原料的拓宽阶段（1960－1970）：特点：解决发酵原料及人畜争粮问题；规模和自动化程度显著提高，能耗过大。此时期称为发酵工程的第四个里程碑，以发酵原料的转变或拓宽为主要特征。6基因工程阶段（1970－现在）：实现了基因的重组和转移；重组细胞、工程菌的构建；随机选育朝定向育种转变此阶段被称为发酵工程的第五个里程碑，是以引入基因工程，达到生物体定向育种为主要特征。发酵工程的内容及特点是什么？1上游技术：优良细胞株的选育：根据发酵的目的选育合适的细胞株营养物的准备：培养基的筛选与制备等最优发酵条件的确定：根据生物体种类，选择最优的发酵条件2发酵工程技术：是发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。包括：----灭菌的技术：培养基、发酵罐、管道等的灭菌；----空气过滤技术：向发酵罐中通入无菌的空气；----计算机控制技术：转速、温度、pH值、补料、消泡控制等。3下游工程技术：产品的分离纯化技术固液分离技术：离心•过滤•沉淀细胞破壁技术：超声•高压剪切•渗透压•溶壁酶蛋白质纯化技术：沉淀法•色谱法•超滤法产品的包装处理等技术：真空干燥•冷冻主要的生物发酵类型有哪几种？各有什么特点？1微生物菌体的发酵：以获得微生物菌体为目的。传统菌体发酵：工业酵母发酵；菌体蛋白（单细胞蛋白）发酵现代菌体发酵：工业杀虫剂：苏云金杆菌，蜡样芽孢杆菌，侧孢芽孢杆菌、白僵菌、绿僵菌；疫苗新的菌体发酵产品:药用功能菌体：茯苓菌→茯苓；担子真菌→灵芝、香菇类；虫草头孢菌→虫草；密环菌→天麻2微生物酶的发酵：酶制剂生产：目前工业应用的酶大多来自于微生物发酵生产。酶试剂盒：医用诊断试剂盒、工业分析试剂盒等药用酶制剂：胆固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶等食品工业用酶制剂：果胶酶，淀粉酶等基因重组技术用酶制剂：核酸酶（nuclease），包括DNA、RNA的内切酶、外切酶，DNA限制性内切酶、DNA连接酶等饲料酶制剂：木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶等3生物体代谢产物发酵：生物体代谢产物发酵是生物体发酵的主要类型，以获得生物体的初级代谢产物如氨基酸、蛋白质、核酸、核苷酸、多糖等，或者次级代谢产物如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等为目的。该技术优点：不受气候环境影响，不受病虫侵害，不破坏资源、环境，可在人工控制条件下进行工厂化生产。红豆杉细胞大规模培养生产紫杉醇。4生物体转化发酵：以转变化合物结构为目的。生物体中含有复杂的酶系统，可以催化氧化、还原、糖基化、羟基化、脱水、脱羧、异构化等反应；可将价格低廉、活性不高或含量大的化合物转化为结构复杂、活性更好的化合物；或者可以改善原化合物的缺点。与化学合成法相比，具有以下优点：高度的选择性（对映体选择性、区域选择性等），反应步骤简单（通常为一步反应），环境友好（不需要使用多种有毒的化学试剂）。2005年，Yang等用五种植物培养细胞（长春花、桔梗、银杏、紫杉和商陆悬浮细胞）生物转化α-山道年（α-santonin），获得11种转化产物，其中4个为新化合物。5生物工程细胞的发酵：获得重组细胞或其代谢物为目的,利用生物工程技术获得细胞，如DNA重组的“工程菌”，细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵。人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位两个基因构建融合基因（LTB－UreB），共表达成为LTB分子内佐剂的融合蛋白，在大肠杆菌中获得高表达。对此基因工程菌发酵工艺经多批次发酵，对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行优化，就可为规模化工业生产打下基础。发酵工程的特点：发酵过程一般是在常温常压下进行的生化反应，反应安全，要求条件较简单。可用较廉价原料生产较高价值产品。反应专一性强。能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位的生物转化修饰。植物细胞发酵的工艺流程外植体的选择→愈伤组织的诱导→细胞的悬浮培养→细胞的扩大培养→细胞的生物反应器培养→产品的提取、分离、纯化高产细胞株的筛选 优良细胞株的选育1优良微生物的选育工业发酵菌种：不能是病源菌;发酵周期短；不产生副产物；菌种原料来源广；纯度高，遗传稳定，抗噬菌体能力强；对前体物质有耐受能力工业中常用菌种的分离和选育：经典育种：自然选育；诱变育种定向育种：杂交育种；转化与转导；原生质体融合2高产植物细胞株的筛选三种情况：第一，培养细胞中有用成分含量高且稳定，连续继代多年不发生变化；第二，最初培养细胞中有用成分含量不高，但重新驯化、筛选和调整培养条件后可显著提高，甚至远高于亲本植株；第三，培养细胞不合成或极微量合成亲本植株所具有的有用成分，这种情况常是由于未找到适于细胞表达的条件或具备高表达能力的细胞数量太少，因而从总体上反应不出适合工业化的细胞株：（1）分散性好，适于工业化操作；（2）均一性好，细胞形状大小大致相同，甚至在生理生化状态上同步；（3）生长迅速；（4）细胞中次生代谢产物含量高；（5）细胞生长和次生代谢产物合成能力稳定。培养基的组成？1基本营养物质：碳源、氮源（NO3-、NH4+特殊有机氮源；细胞生产能力取决于NO3-和NH4+之比，高于或低于最佳比例均可对细胞生长和次级代谢产物的累积产生不利影响）、无机盐、微量元素碳源对细胞生长及次生代谢物生产的影响：植物细胞培养中使用最多的碳源是碳水化合物，碳源对次级代谢产物的影响主要取决于所使用的碳水化合物的种类和浓度。糖是使用最广泛、作用最强的碳源。蔗糖的作用取决于产物的生物合成过程，其作用为：①延长稳定期（可延长至30天至45天)；②通过蔗糖分解后的产物所产生的对内源性生长素合成的抑制作用；③增强戊糖磷酸化途径有关酶的活性。有人曾将葡萄糖和果糖按比例进行混合，但得到的混合物并不能取得类似蔗糖的作用2水：溶剂与运输介质；参与细胞内生化反应；维持生物大分子的天然构象；控制细胞内温度；维持自身正常形态3前体：当人们将某些化合物加入到培养基中后，这些物质可直接被生物体在生物合成过程中结合到产物分子中去，这些物质被称为前体。产物的产量因前体的加入有较大的提高。4促进剂和抑制剂：通过促进或抑制某一反应途径的发生来调节生物体的代谢，使生化反应途径集中在目标产物的形成上，从而提高产品的产量和质量的物质，前者称为促进剂，后者称为抑制剂。植物生长调节剂在植物细胞培养中起着非常重要（或关键性）的作用。但由于植物材料和生理状态的差异，无规律可循，必须通过大量的实验才能确定植物生长调节剂的种类和用量。培养基建立过程：由一种已被广泛采用的基本培养基(如MS或B5)开始→做定性和定量的变动→无机成分和有机成分分别处理→调节生长调节剂培养基配制的基本过程？在量筒中按比例定量加入各种母液、激素→称量蔗糖，烧杯中溶解，转移至量筒，定容→调pH值至5.70～5.75→分装培养基，添加琼脂（固体培养基）→封口，灭菌，摇匀，冷却后备用染菌的不良后果消耗营养合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难；改变pH；分解产物；噬菌体破坏污染原因分析：①种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底⑤操作失误常用的灭菌方法？各有什么特点？1干热灭菌法2湿热灭菌法：用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法。由于蒸汽潜热大、穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。产孢子的微生物则应采用灭菌后适宜温度下培养几小时，再灭菌一次，方能杀死刚刚萌发的孢子。3火焰灭菌法4射线灭菌法5化学药品灭菌法6过滤除空气净化1辐射杀菌：γ射线,紫外辐射,电离辐射等•2加热灭菌：将空气加热到一定温度并维持一定时间，以杀灭空气中的微生物•3静电除尘：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的•4介质过滤：使空气通过定期灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物颗粒阻截在介质中以达到除菌目的发酵设备1通风发酵设备机械搅拌式发酵罐：该类型发酵罐能适应大多数微生物生长过程，并能形成标准化的通用产品。是微生物发酵首选的发酵罐。罐最大的优点是能使溶质混合均匀。但由于其主要使用搅拌桨进行细胞液的混合，剪切力较大，容易造成植物细胞损伤影响植物细胞生长和代谢，尤其对次级产物生成影响极大，故不适合于植物细胞发酵培养。气动式生物反应器：气动式生物反应器与机械搅拌式反应器相比，其优点是：湍动温和均匀、剪切力小。缺点：（1）当细胞高密度培养时，在高通气量的情况下，易驱除培养液中的CO2和乙烯，影响植物细胞生长；（2）在低通气量的情况下，易造成培养液混合不均。主要包括气升式反应器和鼓泡式反应器两种类型。气升式反应器通过上升液体和下降液体的静压差实现气体循环，比鼓泡式反应器有更均衡的流动形式。分为内循环气升式反应器、外循环气升式反应器。1.3搅拌气升式反应器：综合了机械搅拌式反应器和气升式反应器的优点，是一种新型的反应器。它能同时解决传统搅拌和气升式反应器的一些限制，从而引起了国内外学者的广泛关注。2厌气发酵设备：因不需要通入昂贵的无菌空气，因此在设备放大、制造和操作时，都比好气性发酵设备简单得多，其运行成本也降低许多。3其它生物反应器：3.1电泳管膜生物反应器：基本结构：在柱反应器中心轴处有一空心陶瓷管，陶瓷管内放有阴极铂丝，外面则绕有阳极铂丝。在通电情况下，带电物质在阴极与阳极之间可发生电泳现象和细胞膜内带电物质的电渗现象。它可有效除去胞内次级代谢产物，维持细胞正常生长。3.2亲和层析生物反应器：该设备适用于培养重组后的植物细胞。在半连续发酵过程中，可利用亲和层析柱收集在发酵液中的异源蛋白。该反应器有效地解决了植物细胞分泌的蛋白在发酵液中的不稳定问题。3.3光生物反应器：此类生物反应器是植物细胞培养所特有。3.4植物细胞固定化反应器：（1）胶粒固定反应器：①流化床反应器(fluidized-bedreactor)：流化床反应器是一种循环反应器，利用流质的能量使支持物颗粒处于悬浮状态。流体可在高速下操作，有较长的停留时间，使反应混合均匀。但流体的切力和固定化颗粒的碰撞常使支持物颗粒破损，另外，流质动力学复杂使其放大较困难。②填冲床反应器(packed-bedreactor)：在填冲床反应器中，细胞固定于支持物表面和内部，支持物颗粒堆叠成床，培养基在床间流动。填冲床中单位体积细胞较多，常使床内氧的传递、气体的排出、温度和pH难以控制。但该反应器更易实现高密度培养。（2）膜反应器：此类反应器系采用具有一定孔径和选择透性的膜固定植物细胞。①中空纤维膜反应器：中空纤维膜反应器是最常用的固定化细胞设备，通常是在一个管壳内包有一个或多个中空纤维，培养基通过管壳两端的联管箱进出纤维。中空纤维膜反应器提供了高的比表面积，因而营养液流通量很大。中空纤维膜反应器还具有较高的机械强度。②平板膜反应器与中空纤维膜反应器相比，单位体积的比表面积要小很多，且没有足够的机械强度，需附加膜支持物。但其优点是含有微粒或者高黏度的营养液可在此反应器中进行。平板膜反应器易于建造，可在实验室方便地试验各种形式的膜。细胞层厚度易于控制，便于研究膜固定化微环境对细胞生理的影响。③管式膜反应器：管中装入含高浓度细胞的溶液，管壁允许营养液进入细胞层，透析管能用于固定化任何细胞，目前仅限于植物细胞培养。应用多孔管降低了植物细胞装填的难度及膜传质阻力。④螺旋卷绕反应器：将固定有细胞的膜卷绕成圆柱状。此膜反应器的操作压下降明显，流体动力学易于控制，放大容易。发酵的主要操作方式（见单细胞培养的培养方式）1分批发酵：又称分批培养2连续发酵3补料分批发酵：补料分批发酵，是介于分批发酵与连续发酵之间的一种操作方式。它同时具备两者的优点，是一种在工业上比较常用的操作方式。单一补料分批发酵：在开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳源或/和氮源或/和其他必须基质，直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。反复补料分批发酵：在单一补料分批发酵的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大操作容积，从而在理论上可以延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出。4固定化培养：优点：保护细胞免受剪切；细胞可长时间重复使用；细胞的高密度培养；细胞间接触良好，易于分化；易于实现连续化。根据细胞固定化时所用载体物质的种类和细胞被固定的方式的不同，可将植物细胞的固定化方法分为凝胶包埋、膜固定化、共价交联、吸附、表面固定化和多孔载体固定化等。采用固定化细胞培养的先决条件是细胞的代谢产物必须分泌到细胞外，但大多数植物次级代谢产物是存在于胞内或分泌到液泡中的。因此，人们可借助表面活性剂或其它改变细胞通透性的方法，使代谢产物分泌到培养基中。发酵过程的控制与优化：决定发酵单位(水平)的因素：1生物因素：菌株特性(营养要求、生长速率、呼吸强度、产物合成速率)2外部环境因素：设备性能：传递性能；工艺条件：物理：n、T、Ws化学：pH、DO、浓度发酵过程的控制参数主要有哪些？1物理参数：①温度对发酵的影响：1对微生物生长的影响：微生物的生命活动是酶促反应过程•温度升高，生长加快；温度过高，死亡。2对微生物细胞内酶的影响：温度越高，酶反应速度越大；细胞的代谢速度加快，产物提前合成，菌体易于老化，影响最终产物3对发酵液物理性质的影响：影响氧的溶解、传递；影响微生物对某些基质的分解吸收速率，影响发酵过程4对生物合成方向的影响：金色链霉菌的发酵：温度低于30℃：金霉素；温度35℃：四环素。适合微生物生长的温度不一定适合产物的合成。在实际发酵生产过程中，往往不能在整个发酵周期中仅选择一个最适的培养温度。②泡沫：泡沫的产生：通气和搅拌；代谢气体的逸出；存在稳定泡沫的表面活性剂不良影响：1降低装料系数•装料系数为0.6－0.7，剩余空间用于容纳泡沫2引起“逃液”•导致产物的损失3增加了污染杂菌的机会•泡沫“顶罐”、发酵液随着泡沫溅到轴封处均易引起染菌4影响通气搅拌的正常进行•妨碍了生物体的呼吸，使发酵异常消除和控制机械消泡：原理：依靠机械强烈振动，促使气泡破裂，或者借助于机械力将排出气体中的液体分离回收而达到消泡的目的。方式：罐内消泡和罐外消泡。罐内消泡最简单的装置是在搅拌轴上方安装消沫桨，使泡沫借助旋风离心场压制。罐外消泡则是将泡沫引出发酵罐外，通过喷雾或离心作用消除泡沫。机械消泡的优点：不需要在发酵液中引入消泡剂等外界物质，可以减少发酵液性质复杂化的程度，节省材料，减少污染机会；缺点：不能从根本上消除使泡沫稳定存在的因素。化学消泡：由于泡沫形成的原因很多，故化学消泡的机理亦各异。化学消泡剂多为表面活性剂，当将其加入到发酵体系中时，由于消泡剂本身相对较低的表面张力，当它与泡沫接触时，会使气泡膜局部的表面张力降低而使气泡破裂。当泡沫表层存在极性的表面活性物质而形成双电层时，则可加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度，或加入某些强极性的物质，来与发泡剂竞争液膜上的空间，降低液膜的机械强度，从而使泡沫破裂。消泡剂：要求同时降低液膜的机械强度和表面粘度，并具有较小的表面张力和水溶性。（1）对生物体无毒，对人畜无害；（2）不影响生物体的生物合成；（3）消泡作用高效迅速持久；（4）能耐受高压灭菌而不变性；（5）不干扰发酵分析系统，且消泡剂来源广泛；（6）对设备无腐蚀性或不形成腐蚀性产物；（7）不影响发酵的下游加工等。2化学参数：①PH：随着微生物的生长和代谢产物的分泌，发酵液中的pH一直处于变化之中。微生物代谢对pH影响主要在两种情况下发生：①酸性或碱性代谢产物的生成或释放；②菌体对培养基中生理酸性或碱性物质的利用。引起发酵液中pH下降的因素1）C/N过高，或中间补糖过多，溶氧不足，致使有机酸积累，pH下降；2）消泡剂加得过多：脂肪酸增加；3）酸性产物形成：如有机酸发酵引起发酵液中pH上升的因素1）C/N过低（N源过多），氨基氮（NH4＋）释放；2）中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多；3）碱性产物形成pH对微生物生长的影响：每一类菌都有其最适pH和能耐受的pH范围细菌:pH6.3～7.5；霉菌和酵母菌：pH3～6；放线菌：pH7～8控制一定的pH值，不仅保证微生物生长，而且防止杂菌感染pH影响代谢方向：pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变选择pH准则：获得最大比生产速率和合适的菌体量，以获得最高产量。pH调节方法：配制合适的培养基，有很好的缓冲能力；发酵过程中加入非营养基质的酸碱调节剂(NaOH、HCl、CaCO3)；发酵过程中加入生理酸性或碱性基质，通过代谢调节pH；酸性基质：铵盐、糖、油脂、玉米浆(脱NH4＋)碱性基质：NO3－盐、有机酸盐、有机氮、氨水、尿素原则:①残糖高时，不用糖调pH②残N高时，不用生理盐调pH。pH控制与代谢调节结合起来，通过补料来控制②溶解氧：发酵液中溶解氧的控制，需从供氧和需氧两个方面来进行。溶氧浓度的大小与发酵罐的结构、通风和搅拌、菌体的浓度等因素直接相关。搅拌器的直径越大、转速越快、溶氧浓度就越大；（2）增大通风量，可增加通气线速度，增加溶氧浓度；（3）发酵液稀薄、粘度小，氧的传递阻力就小；（4）通过控制发酵过程中的补糖等方式控制适宜的菌体浓度，控制发酵对氧的需求，也可以使发酵过程中的需氧和供氧维持相对平衡。3生物学参数发酵的下游处理：发酵液的预处理和固液分离：发酵液与菌体分离常用的。方法有过滤（常压过滤、加压过滤、真空过滤）和离心分离。发酵产品如果是胞内产物，则首先进行要细胞破碎，再分离细胞碎片。常用的细胞破碎方法可分三类：物理法（高速珠磨法、高压匀浆法、超声波法）、化学法（酸热法、化学渗透法）、生物法（酶解法）。产物的提取：常用的提取方法有沉淀法（有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、盐析法）、吸附法（物理吸附、化学吸附）、萃取法（溶剂萃取、超临界萃取）、离子交换法、膜分离法等。产物的精制：色谱法：如：吸附色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、逆流色谱等。结晶法：结晶是使溶质以晶态从溶液中析出的过程。主要用于低分子量物质的纯化。产品的加工：发酵产物经提取和精制后，尚需对产品进行某些加工，如：浓缩：如：蒸发浓缩、冷冻浓缩、吸收浓缩等；无菌过滤/去热源干燥：如：加热干燥法、冷冻干燥法、升华干燥法等；包装固态发酵的优缺点？液态发酵的缺点：消耗大量的工业用粮以及存在环境污染等问题。固态发酵的优势：（1）培养条件相对粗放；（2）培养基只需要比较简单的前期处理，工业生产的资金投入比较少（尤其在工业生产前期），有利于规模化生产；（3）固态发酵的产品性能较好、工业生产时环境污染比较小，更有利于生物循环。固态发酵的缺点：大规模生产时散热比较困难，参数检测如pH值、温度、菌体增殖量、产物生成量是很难实现固态发酵的分类（1）自然富集固态发酵（2）强化微生物混合固态发酵（3）限定微生物混合固态发酵（4）单菌固态纯种发酵3.固态发酵过程中需控制的参数及其对发酵的影响1基质（底物）：是指在固态发酵过程中为微生物提供所需营养，且作为细胞的固定物的物质。特性：颗粒的大小直接影响到单位体积反应表面积，也会影响颗粒间菌体的生长、氧的供给率及二氧化碳的移出率。小的底物颗粒可以提供较大微生物攻击表面积，可以明显提高固态发酵反应速率，缺点是易造成底物积团。大颗粒由于存在较大间隙有利于提高传质和传热效率，还可提供更好的呼吸及通气条件，缺点是：微生物的攻击表面积较小2无菌操作：液态发酵：杂菌在含水量高的液体培养基中比发酵使用的生物体生长更好，故要求无菌操作。固态发酵：微生物优于杂菌生长，因此，无菌要求不是特别高3过程控制参数：水活度：基质含水量的变化，对微生物的生长及代谢能力有重要影响。水活度＝湿料饱和蒸汽压／同样温度下纯水饱和蒸汽压。底物的性质、最终产物的类型及微生物的需求同决定底物含水量的水平，不同微生物，水活度亦不同通气与传质：通气：固态发酵利用的微生物几乎都是好氧性的，空气的通气率特别重要。空气速率增加既可以提供微生物所需氧，又可以移走反应热和二氧化碳，提高传质、传热效率。在实验室及工业化大生产中，一般利用强制通无菌空气来达到通风的目的。传质：以颗粒状多孔或纤维状物质做底物；减小底物厚度；增大底物间空隙；使用多孔浅盘发酵；搅拌底物或使用转鼓反应器。目前利用较多的方法是把强制通风与搅拌相耦合，但要定时换气或改变气体流向来防止涡流的产生。温度：一方面微生物需要适宜的生长温度（真菌生长的最适温度为20-30℃）；另一方面伴随微生物生长，会产生大量的热，又因为固态发酵传热效率差，易导致床温急剧上升（真菌致死温度在50-60℃）。如果产生的热不能及时散去，温度会影响孢子发芽、生长和产物的产率。N.P.Ghildyal等研究填料床固态反应器中温度梯度对产物的影响，温度梯度严重影响酶活性，利用强制通风、冷凝蛇管或夹套冷却来消除上述问题。促进传热，酶活性相对增加pH控制生物转化生物转化（Biotransformation,Bioconversion）亦称生物催化(Biocatalysis)，是利用植物离体培养的细胞或器官、动物、微生物及细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应。生物转化的特点：1反应类型丰富：酶的种类多种多样，可进行各种生物转化反应。2高度的专一选择：酶的催化反应,具有高度的立体结构选择性。性•3反应条件温和、能耗低、效率高：减少产物分解、异构、消旋和重排反应，不需对基团进行保护，特别适用于不稳定化合物的制备。4生物转化可以减少反应步骤：生物体含有复杂的酶体系，可以将几步催化反应在一次反应中完成。常见反应类型：见PPT微生物转化的一般实验方法？1菌种的选择：要根据转化反应的类型，选择含有能催化该类反应的酶的微生物2培养基的制备：要求培养基的成分能使菌体有丝生长丰满，并富含需要的酶。3转化底物的添加：①选择适当的菌株生长期加底物；②选择添加底物的方法和方式。4刺激剂或抑制剂的添加：为了提高酶活力和增加酶生长量；抑制酶副反应或抑制其它对反应不良酶的生长5各项影响因素的调控：开始加底物的时间，加入的底物和转化的产物在转化环境中最大稳定的滞留时间，适宜的转化温度、pH和菌丝浓度等6转化反应终点的控制：当取样分析反映转化培养液中转化产物积累量不再增加时，立刻去除菌丝体（包括转化反应的胞外酶）及培养物的供应来停止转化反应7分离纯化转化产物微生物转化的操作方式有哪几种？各有什么优缺点？用微生物对中药活性成分进行结构修饰转化，或者对中药复方的复杂成分进行发酵转化，常用的方法有游离细胞转化和固定细胞转化。1游离细胞转化时，微生物的转化活性较高，但是转化产物、底物和微生物的培养介质混合在一起，给下游的分离纯化带来了一定的干扰，且每一次转化都需要首先培养微生物细胞。2固定细胞转化可以长期保持微生物的稳定性，并可以反复使用，但是其生物转化活性比游离细胞转化活性低，且丝状真菌的固定化较为困难。微生物转化方式包括：分批培养转化法：分批培养转化法是指在微生物细胞培养一段时间以后，将转化底物直接加到微生物发酵的培养基中。在微生物生长、繁殖的同时，完成对底物的生物转化过程。一般在对数生长期加入底物。分批培养转化法的优点：操作简单、转化效率高。缺点：发酵液成分复杂，对转化产物的分离纯化有一定困难。渗透细胞转化法：促进底物渗入胞内，与酶充分接触，同时便于转化产物渗出胞外，适合胞内酶作用的生物转化。增大细胞渗透性的方法：采用表面活性剂或有机溶剂，也可利用抗生素。静息细胞转化法：静息细胞是指活的而不再生长的菌丝体，它保持有各种酶的活力。静息细胞培养转化法:又称为替代培养法，是指首先进行微生物菌体的发酵培养，然后通过离心、过滤等方法收集发酵培养的微生物菌体，再将菌体悬浮在含有底物的水或缓冲液中进行生物转化的方式。这种转化方式将细胞的生长影响降低到了最低状态。优点：产物处理简单，减少副反应的发生，反应时间较短，可反复使用缺点：增加了细胞收集和重新悬浮的过程。干燥细胞转化法：应用干细胞进行转化是将培养好的菌体制成干细胞，使用时将其悬浮，然后进行转化。这是另一种静息细胞转化法，具有便于贮备，使用方便等优点。干细胞制备包括真空干燥法和丙酮干粉制备法，都是在低温条件下对培养好的菌体进行干燥，并须冰冻保存，以保持活力此法实质上是制备保存菌体中的粗酶。孢子转化法：细菌的内生孢子一般无活性，但真菌的分生孢子和子囊孢子往往酶活力较高。微生物孢子催化的反应类型通常与生长细胞相似，某些微生物的孢子还能催化生长细胞难以催化的反应。微生物孢子比静息细胞更稳定，常常能反复使用多次。有些类型孢子在冰冻条件下可保存数年，但也有些孢子在冰冻条件下不稳定，须新鲜制备。微生物孢子一旦萌发，其酶组成就会发生改变，不利于转化反应的进行。因此，以微生物孢子进行生物转化时，应该控制转化条件，抑制孢子的萌发，通常的做法是通过控制转化液中的碳源、氮源等营养物质，使孢子稳定在不萌发的状态。固定化细胞转化法：固定化细胞转化法是将生物细胞包埋或吸附在惰性基质表面，用于催化生物转化反应的转化方法。固定化细胞很容易与转化产物和底物分开，有利于产物的分离纯化。可以长期保持稳定，并可以反复使用，有利于采用连续操作工艺。生物转化活性比游离细胞的生物转化活性低，原因是由于固定化基质影响了底物进入细胞。对于这类底物，通常在加样时采取少量多次添加的方法，以避免底物对微生物细胞初级代谢产生太大的影响。底物的加入：液体法（通常是将底物