蛋白质的表达2

AnExampleofproteininvestigationExpressionofprotein人工合成尿素自然界的矿物等无机物千年万年，亘古不变，是没有生命的；而有机物不同，是有生命的。无机物----有机物（生命）动植物体内存在着一种生命力，只有依靠这种生命力，才能产生出有机化合物，即有机物只能在有生命生物体内产生。化学家在实验室只能将有机物转化为新的有机物，而不能用无机物制造出有机物。2NH4Cl+AgCNO—NH4CNO+AgCl

NH4CNO（热）——（NH2）2CO有机化学第一人-维勒（1800-1882）

蛋白质的生物合成胰岛素—有生物活性的蛋白质

Invitro

：invitroproteinsynthesissystem

ProkaryoticExpressionSystem-E.coli,B.subtilis

Invivoyeast

Eukaryotic

ExpressionSystem

insectcells

mammaliancellsⅠ.ExpressionsystemⅡ.ProkaryoticExpressionSystem

Escherichia.coli,becauseofthewealthofknowledgeregardingitsbiochemistryandgeneticscanbeconsideredagoodfirstchoiceforthepreparationofproteins.However,E.colimightnotyieldproteinsuitableforanalysis,thenothersystemsmustbeexamined1.基因表达在原核生物与真核生物中的差别？原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。2.真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法将真核基因克隆到1个强大的原核promotor和SDs的下游,使真核基因处于原核启动子的控制之下,转录物由于原核SDs能与核糖体rRNA结合,可在原核表达.这是克服1,2困难的好办法.从真核分离出mRNA并逆转录成cDNA,cDNA有完整的编码顺序,但无内含子是采用伪装办法→将真核基因插到原核基因某密码之后,其翻译产物N端有原核多肽,这样表达的融合蛋白,可躲避细菌蛋白酶降解作用.1.细菌RNApol不能识别真核的promotor,故真核基因不能被该酶转录.2.从真核转录的mRNA缺乏SD序列,不能结合到细菌核糖体rRNA,因此不能被翻译成蛋白.3.真核基因有内含子,而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统,成熟的mRNA不能形成,不能表达真核蛋白;4.表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定,易被细菌蛋白酶降解.3.大肠杆菌表达载体的组件复制起始点originofreplication选择性基因selectionmarker多克隆位点MCS启动子promoter终止子terminator核糖体结合位点ribosomebindingsiteProkaryoticExpressionSystem复制起始点

保证载体可以正确复制和增殖pBR322和pUC的复制起点，它们皆来源于ColE1质粒质粒具有不相容性通常表达载体都会选用高拷贝的复制子选择性基因至少有一个选择性基因，可用于转化体的确定，并可在培养过程中保持质粒的稳定性。LB倒板前加抗生素的温度超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢多克隆位点具有单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因的插入3.1启动子启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。-10区（pribnowbox）和-35区组成分类转录形式组成型诱导型强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

启动子转录调控机理

具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）

正调节因子CAP

负调节因子lacIIPTG诱导启动子--LacLac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

lacI

PlaclacO

lacZlacYlacA高效转录cAMPCAPlacI

PlaclacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录Lac表达系统

正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac

介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPLac表达系统lacUV5突变体PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。Lac表达系统

负调节因子lacI在无诱导物情形下，lacI

基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacI

PlaclacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录lacI

PlaclacO

lacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNA转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达IAA诱导启动子--TrpTrp表达系统以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

Trp表达系统

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效转录mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶Tac表达系统tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。

调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于

trp和lacUV5

启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

杂合启动子--TacPL

和PR

表达系统

以l噬菌体早期转录启动子PL、PR

为核心构建的表达系统

在野生型l噬菌体中，PL、PR

启动子转录与否决定了l噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。温度诱导启动子--PL和PRPL

和PR

表达系统

转录调控的机理由l噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL、PR启动子转录的阻遏物。cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI

基因产物的产生和消失是相当困难的。

因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。

在较低温度（30℃）时以活性形式存在在较高温度（42℃）时失活脱落

T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。最常用启动子--T7T7表达系统T7噬菌体编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。T7表达系统转录调控的机理

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

T7RNA聚合酶T7启动子目的基因

T7RNA聚合酶基因？启动子T7表达系统转录调控的机理

化学诱导型噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中

用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为

化学诱导型，类似于Lac表达系统。

T7RNA聚合酶基因

lac

启动子E.Coli（DE3）T7启动子

目的基因T7RNA聚合酶IPTG诱导T7表达系统转录调控的机理

温度诱导型PL

启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。

这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。

T7RNA聚合酶基因PL

启动子E.Coli（CE6）T7启动子

目的基因T7RNA聚合酶热诱导cI857T7表达系统转录调控的机理

双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因

两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型T7RNA聚合酶热诱导T7启动子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

启动子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpR3.2TheTerminatorStopsRNAsynthesisatspecificpointsalongtheDNAtemplateTheenzymestopspolymerisingnucleotidesintoRNA,releasestheRNAchainandleavestheDNAtoeventuallyreinitiateatanotherpromoter.Features:AdyadsymmetryintheDNA,centered15to20nucleotidesbeforetheendoftheRNAthisleadstoatranscriptthatcanformanhairpinloopRunofaboutsixAsintheDNAtemplatewhicharetranscribedintoUsattheendoftheRNAHowcouldthesetwostructural

featurescausetermination?强化转录终止的必要性

外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率终止子核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）

3.3核糖体结合位点核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：

位于翻译起始密码子上游的6–8个核苷酸序列

5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；

翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子

SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5’端若干密码子的碱基序列核糖体结合位点4.常见原核表达系统面面俱到Novagen

纯化--GE（原安玛西亚）

更快克隆Invitrogen

面面俱到Novagen

面面俱到Novagen

是否要用基因本身的起始密码子进行选择是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体你希望用蓝白斑筛选可以使用pETBlue系列载体除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式Novagen提供菌株种类多种菌株:BL21,Rosetta,Origami除了常用培养基LB、TB、M9、M9ZB等：可以直接进行过夜培养培养基OvernightExpress™AutoinductionSystemNovagen还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1DNA、pE