第二章 生物化学技术原理及其应用-1

生物化学技术原理及其应用习欠云动物科学学院2006，9原理？是什么和为什么的问题！基本理论：样品制备（前处理）有效成分的分离（粗分级）纯化与鉴定（细分级）第一章生命大分子物质的制备

生命大分子物质？通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢时所产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物。目的获得纯的和比较纯的生命大分子物质.如何获得?材料的选择与处理；有效成分的抽提；粗品的纯化和纯品的鉴定.制备的一般过程：第一节材料的选择有效成分：是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质；而有效成分以外的其它物质则统称杂质。有效成分含量多；稳定性好；来源丰富；保持新鲜；提取工艺简单；有综合利用价值.

选择原则：所选用的材料主要依据实验目的来确定；根据常用的动物、植物和微生物材料的特点各异，所以材料处理的要求也不同.二、材料的处理1．动物脏器

冰冻干燥(1)冰冻：从刚宰杀之牲畜得到的脏器要迅速剥去脂肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净，若不马上抽提、纯化时，应在很短时间内(25℃时)置-10℃冰库(可短期保存)或-70℃低温冰箱(数月不变质)贮存。人工剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂；采用快速加热(500C左右)、快速冷却的方法、使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去；利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。对含有较多脂肪的脏器需要脱脂

—般脱脂的方法有：对于像脑下垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用；对于含耐高温有效成分(如肝素)的肠粘膜，可在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存。(2)干燥：2．植物组织若是叶片,用水洗净即可使用，或在10小时内置-4℃一-30℃冰箱贮藏备用；若是植物种子，则须泡胀或粉碎才可使用。如材料含油脂较多时，也要进行脱脂处理。

3.微生物特点：种类多、繁殖快、培养简便、诱变容易和不受季节影响;在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量.

培养液收集上清菌体有效成分有效成分(低温下短时间储存)(干粉，40C保存)第二节

细胞的破碎机械破碎；溶胀和自溶；化学处理；生物酶降解.方法：一、机械破碎1）用研磨棒研碎组织,可加入一定量的石英砂(45—50u)。2）用匀浆器处理优点：此法较温和，适宜实验室应用注意：加石英砂时，要注意其对有效成分的吸附作用。如系大规模生产时，可用电动研磨法。细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法。1、研磨法

剧烈的破碎细胞方法。捣碎器(转速8000一10000r／min)处理30一45秒，植物和动物细胞能完全破碎。如用其破碎酵母菌和细菌的细胞时，就须加入石英砂才有效，但是在捣碎期间必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性。因此捣碎的时间不易太长。2、组织捣碎器法它是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。细菌和酵母菌悬浊液用超声波处理时,时间宜长点。有些菌体破碎要5-10分钟，或更长。如果在细胞悬浮液中加石英砂则可缩短时间。为防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。3、超声波法此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用1.77×108-3.54×108Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔(＜细胞直径的孔)．致使其被挤破、压碎。

如高压细胞破碎机.

4、压榨法

将细胞置低温下冰冻一定时问，然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。

5、冻融法二、溶胀和自溶

细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如：红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。1、溶胀细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。应用此法时要特别小心操作，因为水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，同时也可把某些有效成分在自溶时分解。2、自溶三、化学处理用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类等物质，并导致整个细胞破碎.如细胞裂解液。四、生物酶降解

生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用加溶菌酶(来自蛋清)破细胞壁的步骤。第三节抽提指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来和去除杂质的过程.1.可用缓冲液，或稀酸、稀碱、有机溶剂(如丙酮、乙醇)等溶液抽提；2.还可用蒸馏水抽提；3.全蛋白质组抽提试剂盒.1）对有效成分溶解度大，破坏作用小；2）对杂质不溶解或溶解度很小；3）来源广泛、价格低廉、操作安全等。一、理想的抽提溶液应具备下述条件

pH值溶剂的极性和离子强度水解酶温度和搅拌氧化金属离子二、抽提有效成分的影响因子

1、pH值对具有等电点的两性电解质物质，抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内.a.碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提；b.酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提；c.用调至一定pH值的有机溶剂抽提.例如：肝素在酸性pH范围内易受破坏，且不易与脂蛋白分开，而在碱性pH范围内，蛋白质带负电荷，不能与带强负电荷的肝素形成离子键而解离。故采用pH10.5-11的高碱性溶液抽提，效果较好.注意：若在抽提阶段需用弱碱(NH4OH)或弱酸(HAC)控制粗匀浆液的pH值时，注意搅拌，避免局部出现过高的酸、碱浓度，导致所需物质变性；有些抽提过程的最适pH值与使有效成分的活性稳定的pH值并不一致。2、溶剂的极性和离子强度有些蛋白质或酶在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如：提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2mo1/L蔗糖水溶液．才能达到抽提目的。降低极性的方法：在水溶液中增加蔗糖或甘油的浓度；若用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺代替蔗糖或甘油时，会使溶液的极性大大降低；在水溶液中加入中性盐如KCl、NaCl、NH4Cl和(NH4)2SO4能提高溶液的离子强度。一般而言离子强度较低的中性盐溶液促进蛋白质溶解(盐溶)，保护蛋白质活性的作用；离子强度过高则引起蛋白质发生盐析作用.3、水解酶

在抽提、纯化蛋白质或核酸时，其效果常常受到本身存在的水解酶的影响。这些酶在与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。必须小心地采用加入抑制剂(苯甲基磺酰氟化物．简称PMSF)或调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。

4、温度蛋白质或配制品在低温(如0℃左右)最稳定；如在生产人绒毛膜促性腺激素(HCG)制品时，一定要在低温下进行；从鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶正好相反。它对低温敏感，25℃时才稳定。

5、搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，致某些酶类变性失活。

6、氧化一般蛋白质都含有相当数量酶和蛋白质的必须的巯基，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)．在抽提液中加入：1）β-巯基乙醇（1-5mmol/L)2）半胱氨酸(5-20mmo1/L)3)还原谷胱甘肽4)巯基乙酸盐(1-5mmo1/L)等还原剂可以防止巯基发生氧化作用，或者延缓某些酶活性的丧失。

7、金属离子蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和来源于制备缓冲液的试剂中的金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。解决的办法：用无离子水或重蒸水配制试剂；在配制的试剂中加1-3mmo1/LEDTA(金属离子络合剂)。

8、抽提液与抽提物的比例在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以5:1为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。否则反之。第四节

浓

缩抽提液的体积若比较大，应先进行浓缩处理。方法：一、沉淀法二、吸附法三、超过滤法四、透析浓缩法五、减压蒸馏浓缩法六、冰冻干燥法在抽提液中加入适量的中性盐，如硫酸铵[(NH4)2SO4]或有机溶剂，使有效成分变为沉淀。经离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，再经离心除去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。一、沉淀法将干葡聚糖凝胶G25(或吸水棒)加入抽提液中，两者比例为1:5。由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左右．回收蛋白质量约80％。当凝胶(或吸水棒)对有效成分吸附力强或吸水后对有效成分的性质有影响时。此法不宜采用。二、吸附法

把抽提液装入超过滤装置(见图)，在空气或氮气(5.05×105Pa)压力下，使小分子物质(包括水分)通过半透膜[如硝酸纤维素膜),大分子物质留在膜内。用此法在12小时内可使50毫升样品浓缩到5毫升。

三、超过滤法把装抽提液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇(polyetheyleneglycol，分子量20000以上，简称PEG)或甘油中,10毫升抽提液可在1小时内浓缩到几乎无水的程度。这种