nm23、vegf-c及其受体vegfr-3在大肠癌中的表达及意义

nm23、vegf-c及其受体vegfr-3在大肠癌中的表达及意义

癌症的主要转移方式是淋巴结和血液转移，血管内生长因子（vegf）及其受体是肿瘤淋巴管和新血管形成的重要因素。VEGF-C主要作用是与VEGFR-3和VEGFR-2相结合,从而介导肿瘤淋巴管、新生血管的生长和增殖,促进肿瘤细胞生长和侵袭。nm23是肿瘤转移抑制基因,该基因缺失、突变或功能丧失会促进肿瘤的发生和转移。本文采用免疫组化方法检测nm23、VEGF-C和VEGFR-3在大肠癌组织及正常大肠组织中的表达水平,以探讨其在大肠癌中的临床意义及与淋巴结转移的关系。1材料和方法1.1患者临床分期抽取2005年9月至2006年11月在我科手术的97例大肠癌患者,所有病例术前均未放疗与化疗,术后均经病理证实。患者年龄22~82岁,平均59岁。按Duckes标准进行临床分期:A期21例,B期40例,C期23例,D期13例。根据大体分型分为:肿块型27例,溃疡型63例,浸润型7例。根据组织分化程度分为:高分化4例,中分化80例,低分化13例。有淋巴结转移者31例,无淋巴结转移者66例。另取97例癌旁正常大肠组织为对照。1.2免疫抗体检测兔抗人VEGF-C多克隆抗体,兔抗人VEGFR-3多克隆抗体,鼠抗人nm23多克隆抗体,SP试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.3内源性过氧化物酶基因采用免疫组织化学方法(SP法)。标本经10%甲醛固定,石蜡包埋,4μm厚连续切片,常规脱蜡及水化,3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,枸橼酸缓冲液微波法修复抗原,正常山羊血清室温下湿孵10min,滴加一抗,4℃过夜;加入二抗,37℃温箱孵育30min,加入辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃温箱孵育30min;DAB显色,苏木素复染,自来水洗蓝化,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。1.4vegfr-3检测nm23、VEGF-C和VEGFR-3阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色,nm23与VEGF-C定位于细胞浆内,以肿瘤细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性;VEGFR-3定位于癌周间质细胞及淋巴管内皮细胞,以间质细胞内或脉管内皮细胞内出现棕黄色颗粒为阳性,阳性淋巴管多位于癌周间质内,为壁薄、形态不规则的管腔。记数200倍视野下每100个细胞中nm23、VEGF-C和VEGFR-3染色阳性的数目(nm23与VEGF-C计数肿瘤细胞,VEGFR-3计数间质细胞),共计5个视野,取记数平均值,阳性率用百分数表示,以>20%为阳性表达。1.5统计方法应用统计学软件SPSS11.0处理实验结果。各组及组间比较用χ2检验,P<0.05为有显著性差异。2结果2.1肺癌vegf-c表达与正常组织的比较nm23、VEGF-C和VEGFR-3在癌细胞及正常大肠细胞中都可见阳性表达(表1),nm23在97例大肠癌中阳性表达为53例(图1),阳性表达率为54.6%,低于正常组织(83.5%,P<0.05);VEGF-C在癌组织中阳性表达为57例(图2),阳性率58.8%,高于正常组织(29.9%,P<0.05);VEGFR-3在癌组织中表达阳性者48例(图3,4),阳性率49.5%,高于正常组织(21.6%,P<0.05)。2.2duckes分期nm23阳性表达与大肠癌患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小无关(P>0.05),差别无统计学意义,与肿瘤分化程度,肠壁侵犯深度,淋巴结转移及Duckes分期有关(P<0.05);VEGF-C和VEGFR-3阳性表达与大肠癌患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度及肠壁侵犯深度无关(P>0.05),与淋巴结转移及Duckes分期有关(P<0.05),差别有统计学意义(表2)。2.3nm23与vegf-c和vegfr-3在肠道表达的比较将97例大肠腺癌中nm23、VEGF-C和VEG-FR-3阳性表达相互比较,用χ2检验验证,nm23与VEGF-C和VEGFR-3在大肠癌中的表达呈负相关,差别有统计学意义(P<0.05),VEGF-C和VEGFR-3在大肠癌中的表达呈正相关,差别无统计学意义(P>0.05)。3讨论3.1酸核苷酸酶活性大肠癌的发生、发展及转移过程十分复杂,多种因素参与和调控。在大肠癌的发展阶段,涉及到转移促进基因和转移抑制基因,nm23是第一个发现的转移抑制基因,与1988年由美国国立癌症研究所Steg等应用差示杂交克隆技术,从7个转移不同的K-1735鼠的黑色素瘤细胞中分离得到,定位于人17号染色体长臂上,编码17kDa蛋白,具有二磷酸核苷酸酶(NDPK)活性,参与体内磷酸核苷的形成,通过影响微管聚合状态及G蛋白介导的信号传导通路而调节细胞代谢,在肿瘤细胞增殖分化侵袭及转移中起重要作用[4~6],但也有一些学者认为大肠癌中nm23蛋白表达与其浸润、转移和预后无明显关系。本研究发现,大肠癌组织中nm23的表达(54.6%)显著低于正常组织(83.5%,P<0.05),差别有统计学意义,提示nm23基因具有部分抑瘤活性,在大肠癌的发生、发展中起一定作用。在97例大肠癌组织中,高分化癌4例,中分化癌80例,低分化癌13例,其中nm23阳性表达53例,nm23蛋白在Duckes分期中阳性表达A、B期显著高于C、D期(P<0.05),N(+)组8例,阳性率为25.8%,N(-)组45例,阳性率为68.2%,有统计学意义(P<0.05),说明nm23对肿瘤细胞的增殖分化及淋巴结转移有抑制作用,nm23蛋白表达与大肠癌的分化及淋巴结转移呈负相关,与相关文献报道一致。本实验说明,nm23基因有抑制肿瘤细胞活性作用,其缺失突变或失活会促进大肠癌的发生及转移,nm23蛋白的低表达作为肿瘤分化侵袭和淋巴结转移的一项指标。3.2vegf-c在肿瘤组织表达与淋巴结转移的关系血管内皮生长因子家族不同成员作为内皮细胞重要调节因子,控制着血管生成、淋巴管生成、血管通透性以及内皮细胞存活,VEGF-C是VEGF家族成员之一,于1997年Jeltsch等首先发现,由119个氨基酸组成,定位于人类染色体的4q34,有两个受体结合部位,分别结合血管内皮细胞表面受体VEGFR-2和淋巴管内皮细胞表面受体VEGFR-3。VEGF-C主要作用于酪氨酸激酶flt-4/VEGFR-3受体,与淋巴系统的许多生理病理过程有关。近年来相关研究证实,肿瘤细胞可通过分泌淋巴管生成因子VEGF-C,诱导肿瘤组织外周或内部淋巴管生成,很多恶性肿瘤组织高表达VEGF-C,并与淋巴结转移有一定关系[8~10]。VEGFR-3是VEGF家族成员之一,一种位于细胞表面的酪氨酸激酶受体,主要表达于成人淋巴管内皮细胞、癌周间质细胞和一些受损的血管内皮中,与其特异性受体结合后可诱导淋巴管的增生。本实验通过对97例大肠癌标本及97例癌旁正常大肠组织VEGF-C和VEGFR-3表达进行观察和统计,结果发现,VEGF-C和VEGFR-3在正常大肠组织中阳性表达为29和21例,阳性率分别为29.9%和21.6%,大肠癌中阳性表达57和48例,阳性率分别为58.8%和49.5%,两者相比差别有统计学意义,提示VEGF-C和VEGFR-3在大肠癌的发生、发展中起重要作用。在大肠癌中VEGF-C和VEGFR-3蛋白的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小及肠壁侵犯深度无关,分化程度越低,表达越高,但差别无统计学意义。VEGF-C在大肠癌Duckes分期中,A、B期阳性表达率(49.2%)低于C、D期阳性表达率(75.0%,P<0.05),N(-)组阳性表达33例,阳性率50.0%,N(+)组24例,阳性率77.4%;VEGFR-3在大肠癌Duckes分期中,从A期到D期阳性表达逐渐升高,差别有统计学意义(P<0.05),N(+)组阳性率(67.7%)明显高于N(-)组(40.9%),与相关报道一致。结果表明,VEGF-C的表达与大肠癌的进展及转移有密切关系,并认为,VEGF-C与VEGFR-3结合后,可通过MEK/ERK和PI3/Akt途径引起肿瘤内和肿瘤周围的内皮细胞增生、迁移及重塑,从而诱导淋巴管的生成和增生,使肿瘤内部和肿瘤周围淋巴细胞及淋巴管增殖活跃,有利于肿瘤细胞的生长繁殖,使肿瘤细胞可以沿淋巴途径向癌周及远处转移,发挥促肿瘤淋巴管新生的作用,是大肠癌进展和转移的促进因子,可作为评价大肠癌恶性程度的指标。3.3vegf-c和vegfr-3对脏器的诱导与诱导本研究证实,nm23与大肠癌的淋巴结转移呈负相关(P<0.01),认为nm23有部分抑瘤活性,可抑制大肠癌的发生及转移,该基因的缺失或突