结肠癌中巨噬细胞浸润情况的检测

结肠癌中巨噬细胞浸润情况的检测

c34骨髓髓质样本前，细胞进入血液循环，成为单核细胞，然后移动到组织中。肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophages,TAM)是外周单核细胞浸润到实体肿瘤组织内及其周围后形成的巨噬细胞。以往认为巨噬细胞具有重要的抗肿瘤免疫调节作用,可以直接杀伤肿瘤细胞,或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答来清除肿瘤细胞。然而近年来发现肿瘤相关巨噬细胞可通过释放一些细胞因子、趋化因子、生长因子或酶,促进肿瘤的发生发展和侵袭转移。我们通过分析肿瘤相关巨噬细胞在结肠癌中的浸润分布,初步探讨其与肿瘤淋巴道转移的关系。1材料和方法1.1正常结肠组织2008～2009年成都军区总医院行外科手术切除的结肠癌标本69例,均为腺癌,均经病理检查证实,术前患者未行任何治疗。其中男性49例,女性20例,年龄34～58(49.06±5.83)岁。Duke’s分期:A、B期35例,C、D期34例。肿瘤分化程度:高分化21例,中分化31例,低分化17例。另取5例正常结肠组织为对照。标本经常规脱水、福尔马林固定、石蜡包埋,连续切片(片厚4μm)。1.2免疫组化染色鼠抗人CD68单克隆抗体、DAB显色试剂盒、SP-9000免疫组化染色试剂盒均购于北京中杉生物技术有限公司。淋巴管内皮细胞兔抗人LYVE-1购于SANTACRUZ公司。1.3淋巴管分布及计数染色操作均按抗体及试剂盒说明书严格进行。主要步骤如下:切片经常规脱蜡水化,3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶,组织抗原修复,血清封闭,一抗4℃孵育过夜;二抗孵育后加入辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育,DAB显色;苏木精复染,脱水透明,中性树胶封闭。PBS代替一抗作为阴性对照。淋巴管分布及计数:采用淋巴管内皮细胞特异抗体LYVE-1用免疫组化SP法进行检测。染色结果判断采用盲法进行,由两名病理医师分别进行。淋巴管计数参考Schoppmann等的方法:即在低倍镜下(×100)选取视野中染色最密集的视野,再换到高倍镜下(×200)进行计数,每例计数3个视野,并求平均值。每个阳性显色的淋巴管内皮细胞、细胞簇或管腔样结构均视为一个淋巴管,同时分别计数肿瘤边缘区域和中心区域的淋巴管。巨噬细胞分布、计数:采用巨噬细胞特异抗体CD68进行,染色方法及计数类似淋巴管。1.4临床表现的分析采用SPSS10.0统计软件进行相关统计学分析。巨噬细胞计数与临床各病理参数的关系用t检验。Spearman相关系数检验分析巨噬细胞和淋巴管计数间的相关性。P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1cd65的组织形态及其与肿瘤组织通过淋巴管内皮细胞特异抗体LYVE-1检测结肠癌淋巴管分布,阳性染色呈棕黄色管腔样或簇状结构。结肠癌淋巴管在数量及分布上存在一定规律,以肿瘤边缘区域多见,可见较多的管腔样结构,数量明显高于正常组织。以巨噬细胞表面标志CD68作为标志物检测其在肿瘤中的分布并计数,CD68阳性呈棕黄色,位于细胞胞浆和胞膜。在各肿瘤组织周围和内部均可看到大量巨噬细胞浸润,以肿瘤周围浸润较明显(图1)。在检测的结肠癌标本中,巨噬细胞计数与肿瘤区域淋巴管计数之间存在明显相关性(r=0.432,P<0.01)。2.2不同细胞分化程度中基层细胞核计数比较表5巨噬细胞计数和肿瘤患者年龄、性别等无明显关系(P>0.05),不同细胞分化程度中,巨噬细胞计数差异也无统计学意义(P>0.05)。但是,Duke’s分期A、B期巨噬细胞计数明显低于C、D期(P=0.023)。见表1。3tam治疗肿瘤的作用机制肿瘤与炎症的关系十分密切,一方面某些慢性炎症能诱发不同种类的癌症,与炎症相关的肿瘤发生率在15%左右。另一方面肿瘤细胞和间质细胞可产生大量的炎症因子(趋化因子),招募外周血中大量的单核细胞进入肿瘤组织形成TAM。研究发现肿瘤组织中的炎症细胞多为巨噬细胞,巨噬细胞数量甚至可达炎症细胞总数的50%。Takanami等检测113例肺腺癌患者手术标本中TAM浸润的密度,发现TAM浸润是独立的预后因素,高密度TAM浸润的患者预后较差。此外,一些研究还提示了在头颈部癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、子宫内膜癌及宫颈癌等恶性肿瘤中均可观察到明显的TAM浸润,并且高TAM浸润状态与预后不良相关。在我们的研究中,TAM的数量与患者年龄、性别、分化程度等均无明显关系;而在肿瘤的分期即是否有浸润转移上有比较显著的关联,TAM浸润多的患者,分期往往也更晚,预后偏差,符合上述观点。根据多项研究的结果,TAM浸润在肿瘤中的作用主要有:(1)促进肿瘤血管形成,加速肿瘤的生长。当肿瘤直径超过2mm时便需要新生血管生成,否则无法继续高速生长。TAM可分泌多种生长因子,如血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PIGF)、成纤维细胞生长因子(FGF-1、FGF-2)、血小板源生长因子(PDGF)及肝细胞生长因子(HGF)等。Zeisberger等、Chen等各自的研究中发现,当清除掉巨噬细胞以后,肿瘤生长和血管生成的速度明显减慢。由此可见,TAM参与血管生成,在肿瘤生长中发挥重要作用。(2)促进肿瘤细胞的侵袭。肿瘤间质存在致密的细胞外基质,是肿瘤细胞在浸润扩散过程中的屏障。肿瘤局部生长及侵袭需要细胞外基质降解。TAM可分泌多种基质水解酶,包括组织蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMPs)、纤溶酶、尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体等,这些酶作用于细胞外基质,破坏基底膜,从而增强肿瘤细胞的侵袭性。Hagemann等将巨噬细胞和卵巢癌细胞或乳腺细胞共同培养后,发现通过肿瘤细胞JNK和NF-κB信号通路的激活,上调肿瘤细胞和TAM基质金属蛋白酶的表达。Hiraoka等用氯磷酸盐脂质体特异性清除巨噬细胞后,明显抑制肺癌骨转移。(3)促进肿瘤细胞的淋巴道转移。目前肿瘤淋巴道转移的机制并不清楚,但普遍认为肿瘤淋巴管的生成有助于癌细胞的转移。VEGF-C/D作为目前比较明确的淋巴管生成因子可由多种细胞分泌。Cursiefen等利用动物角膜模型研究VEGF-A对血管、淋巴管生成作用时,发现VEGF-A可诱导巨噬细胞在角膜聚集,并测得巨噬细胞可分泌VEGF-C,从而诱导角膜内淋巴管生成。当去掉局部单核细胞、巨噬细胞后,淋巴管生成现象消失。Zhang等研究人肺癌时,也发现肿瘤相关巨噬细胞与TNM分期及淋巴结转移密切相关,其密度与肿瘤局部淋巴管密度显著相关。谭海栋等有类似发现。Keriaschki等认为,炎症环境中的巨噬细胞可通过直接分化为淋巴管