青蒿素对小鼠lewis肺癌生长和淋巴管生成的影响

青蒿素对小鼠lewis肺癌生长和淋巴管生成的影响

0青蒿素抑制淋巴管生成的作用机制淋巴结转移是多种肿瘤转移的重要手段，也是肿瘤预后的重要指标。近年来的研究表明，肿瘤可以诱导淋巴管的生成，并促进肿瘤细胞通过新的淋巴管向区域内的淋巴结转移。现在，从各种淋巴管内部特征的发现促进了对肿瘤淋巴管功能的理解。因此，人们可以识别抑制淋巴管生成的药物和方法，这是肿瘤转移研究领域的热点。1972年，中国科学家在中药青蒿中分离了具有抗疟疾作用的单一成分“苦艾酒”。目前，它主要用于治疗抗癫痫药物引起的恶性疟疾。多项研究表明，苦艾酒及其衍生物对各种肿瘤的生长有抑制作用，并表明它们具有很强的抗血管生成功能。然而，尚不清楚什么样的苦艾酒是否能抑制淋巴管的生成。我们讨论了苦艾酒对大鼠lewis肺癌生长、淋巴管生成和肺转移的影响。1材料和方法1.1细胞培养和免疫健康C57BL/6小鼠50只,雌性,4～6周龄,体质量18.1～20.3g,由第三军医大学大坪医院动物实验中心提供.小鼠Lewis肺癌细胞株购于美国典型菌株保藏中心(ATCC),使用DMEM(含10mL/L灭活胎牛血清、100U/mL青、链霉素)培养基,置于37℃,50mL/LCO2孵箱中培养.DMEM、胎牛血清购于美国Hyclone公司.胰蛋白酶,美国BD公司.青蒿素购自重庆市酉阳县武陵山制药有限公司,研磨后用5g/L的羧甲基纤维素钠配成悬浮液.兔抗小鼠VEGFR-3,LYVE-1多克隆抗体购买自美国SantaCruzBiotechnology公司.免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司.收集对数生长期的细胞,胰酶消化后,1000r/min离心10min,PBS洗涤,无血清的DMEM制成细胞悬液,细胞浓度达到5×106.随机选取6周龄的C57BL/6小鼠,在背部皮肤下接种Lewis肺癌细胞,每只0.1mL.1.2小鼠vegfr-3、lyvd-1、lvmd/hs-pcr检测将20只小鼠随机分为对照组和青蒿素治疗组,每组10只,青蒿素治疗组在肿瘤移植后2d即灌胃给予50mg/kg青蒿素0.4mL,1次/2d,连续给药2wk;对照组灌胃相同体积的羧甲基纤维素钠悬液.每2～3d用游标卡尺测量肿瘤最大长径(a)和与之垂直的宽径(b),并计算肿瘤体积:V=0.52ab2.移植后30d脱臼处死小鼠,剥离肿瘤组织,取出肺组织,称取瘤体和肺质量.肺组织用40g/L甲醛固定24h,石腊包埋,切片,常规HE染色,计算光镜下的平均结节数.另取30只小鼠随机分为对照组和青蒿素治疗组,每组15只,观察生存期.肿瘤组织切片用二甲苯脱腊,梯度酒精水化,30mL/LH2O2室温封闭10min,98℃微波热修复抗原10min.SABC染色步骤如下:先用20mL/L正常山羊血清封闭30min,甩去不洗,随后滴加兔抗小鼠VEGFR-3及LYVE-1(1∶500),4℃过夜,PBS洗涤,滴加生物素化的羊抗兔IgG(1∶100),37℃孵育30min,PBS洗涤,加入SABC,37℃孵育30min,DAB显色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,苏木素衬染,中性树胶封片.光镜下观察微淋巴管密度(lymphaticmicrovesseldensity,LMVD)并计数,参考Beasley等的方法,即先在低倍数下(×100)观察切片,寻找肿瘤内染成棕褐色单个内皮细胞或内皮细胞簇,作为一个微淋巴管,含有肌层的细胞不以计数,每个标本在高倍镜下(×400)随机计数10个视野,取平均数作为该LMVD值.统计学处理:计量资料用x¯±sx¯±s表示,采用SPSS13.0统计软件包进行分析.两率的比较用Fisher确切概率法,均数比较用t检验,生存率估计用Kaplan-Meier法,并用log-rank检验,P<0.05表示差异具有统计学意义.2结果2.1两组肿瘤生长和量测小鼠接种Lewis肺癌细胞后8d,在青蒿素治疗组和对照组小鼠背侧皮下均有肉眼可见的肿瘤病灶.接种后15d和20d肿瘤生长在两组之间没有统计学差异(P>0.05,图1).30d脱臼处死小鼠,称量肿瘤重量,发现治疗组和对照组肿瘤也无显著差异(P>0.05,表1).2.2青蒿素对k-b间质的影响通过检测瘤周和瘤内VEGFR-3和LYVE-1表达,我们发现VEGFR-3和LYVE-1主要表达在瘤周间质(图2A,B),定位于淋巴管内皮表面,而在瘤内表达极少,仅表达于少量肿瘤细胞和间质细胞(图2C,D).以LYVE-1阳性淋巴管计算LMVD,高倍镜(×400)下显示,青蒿素治疗组平均LMVD为(9.8±4.2)个,对照组为(34.8±6.5)个,两者之间具有显著性差异(P<0.01,表1).2.3青蒿素对双肺重量的影响脱臼处死接种后30d的小鼠,摘取双肺,电子天平称质量,并制作石腊切片,HE染色观察肺转移灶.结果显示,与对照组比较,青蒿素治疗组双肺重量明显减轻(P<0.05,表1);而且青蒿素组双肺转移的发生率为50%,对照组为100%,两者具有显著性差异(P<0.05,表1);此外,治疗组双肺转移平均结节数和转移灶大小也明显小于对照组(P<0.01,表1).2.4青蒿素治疗组与对照组的死亡情况青蒿素治疗后观察小鼠死亡情况,对照组荷瘤小鼠在19d开始死亡,在55d时全部死亡.青蒿素治疗组在36d开始死亡,在60d时仍有73%存活,明显高于对照组(P<0.01,图3).3青蒿素的保护作用近年的研究证实,肿瘤淋巴管生成与淋巴结转移以及远处转移密切相关,LMVD和微淋巴管浸润(lymphanticvesselinvasion,LVI)是独立的非小细胞肺癌预后指标.在实体肿瘤中,肿瘤细胞或其他间质细胞高表达(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)-C,VEGF-D,通过激活VEGFR-3诱导淋巴管生成,增加的淋巴管密度使得肿瘤更容易进入淋巴管从而运输到区域淋巴结.目前,人们已经使用多种方法来靶向抑制VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信号通路,以期望通过抑制淋巴管生成从而降低肿瘤转移.然而,这些分子靶向措施目前还处于实验阶段,用于临床尚需时日.青蒿素是在世界范围内治疗治疗脑型疟疾和恶性疟疾的主要药物,副作用少.近年的研究发现青蒿素及其衍生物具有较强的抗肿瘤作用,而且可抑制血管内皮细胞的迁移、存活和体外血管形成.在一项体外抗肿瘤实验中发现,青蒿琥酯对肠道肿瘤细胞和白血病细胞的抑制作用较强,而对肺小细胞癌细胞的杀伤作用较弱,其作用强度不到肠肿瘤细胞和白血病肿瘤细胞的1/20.我们应用Lewis肺癌模型,观察了青蒿素对荷瘤小鼠的保护作用,结果显示,50mg/kg的青蒿素可以显著延长荷瘤小鼠生存期,但并未减轻肿瘤负荷.提示青蒿素对Lewis肺癌的抑制作用较弱,其保护作用可能不是由于它对肿瘤细胞具有直接的杀伤作用.VEGFR-3,LYVE-1,Prox-1,D2-40和Podoplanin是常用的淋巴内皮标记物,可以用于肿瘤LMVD计数,从而评价肺癌患者的预后.我们使用VEGFR-3和LYVE-1免疫组化染色标记微淋巴管,并以LYVE-1阳性管腔计数LMVD.实验发现,在Lewis肺癌内少有VEGFR-3或LYVE-1阳性表达,而在实体肿瘤周围有大量新生的微淋巴管.某些研究认为,瘤周高LMVD而不是瘤内LMVD与肿瘤侵袭和转移相关;瘤体产生的静水压将瘤内淋巴管压扁使其不具有功能,而瘤周提供了一个潜在的低张、低压和大容量环境,更有利于肿瘤细胞的渗透和播散.我们发现青蒿素治疗组瘤周LMVD计数明显少于对照组,提示青蒿素具有显著的抗肿瘤淋巴管生成的作用.此外,由于Lewis移植瘤具有高转移至肺的特点;淋巴管生成与肿瘤远处转移也具有相关性,因此我们观察了青蒿素对肿瘤肺转移的影响,结果显示青蒿素显著降低肺转移灶大小,并减少肺转移结节数.因此,青蒿素可能是通过抑制肿瘤肺转移从而提高荷瘤小鼠存活率.关于青蒿素抗淋巴管生成的机制,我们认为其与青蒿素的抗血管生成作用相类似,青蒿素可能从多种途径发挥作用,如抑制肿瘤细胞VEGF-C