药用植物蜘蛛香总黄酮和草三酯提取物药效评价

药用植物蜘蛛香总黄酮和草三酯提取物药效评价

蜘蛛虱子属于官草科。它主要分布在西南少数民族地区。它能口服结论、益气、镇静、消炎、止咳等。其化学成分主要含挥发油、环烯醚萜类、黄酮类［1］。环烯醚萜成分中的缬草三酯类是抗焦虑、镇静催眠、抗肿瘤、解痉等药效成分之一［2］。蜘蛛香的黄酮类化合物主要有橙皮苷、芹菜素、蒙花苷、蒙花苷异戊酸酯等［3］,具有抗炎、抑菌、抗肿瘤的作用［4］。蜘蛛香的水提液具有的显著的镇痛镇静作用,提示其活性成分主要集中在强极性段［5］。环烯醚萜类对实验大鼠肠易激综合征(IBS)具有明显改善作用,同时也被认为是抗焦虑作用的主要成分［6］。现有文献仅见有关蜘蛛香不同溶媒提取物的药理学研究［7－8］,未见蜘蛛香主要成分富集纯化后的提取物的药效学评价。现基于蜘蛛香的总黄酮和缬草三酯类提取物,分别进行了提取物的主要药效学研究,可为蜘蛛香活性成分的筛选和制备医药中间体提供参考。1实验部分1.1实验试剂和动物RB-200智能热板仪、HW400-S恒温平滑肌槽(成都泰盟科技有限公司);YLS-1A小鼠自主活动仪(济南益延科技发展有限公司);JH-2型肌张力传感器(金华雷琪实验器材有限公司);AES-M02型小鼠高架十字迷宫(安来软件科技有限公司)。蜘蛛香药材(湖北省恩施州药材公司,经湖北民族学院朱敏英教授鉴定为败酱科植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根和根茎);元胡止痛片(广西世彪药业有限公司出品,每片0.25g,批号:20110907);香砂平胃颗粒(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂,每袋10g,批号:20110913);地西泮片剂(江西中兴汉方药业有限公司,每片2.5mg,H36020426);氯化钠注射液(浙江康乐药业有限公司);其余试剂为分析纯。ICR小鼠[成都中医药大学动物实验中心,动物许可证号SCXK(川)2011-24],♀♂兼用,体重18~22g;♂家兔[四川省实验动物专委会养殖场,动物许可证号SCXK(川)2008-14],体重2~2.2kg。1.2方法和结果1.2.1总草三酯提取物的制备取适量蜘蛛香药材,以料液比10∶1用65%乙醇浸泡3h后,于室温超声提取(30min×2)。用ADS-8树脂装柱,最大上样量42.3mg·g-1,上样浓度1.692mg·mL-1,先用30%乙醇除杂,后用6BV的95%乙醇洗脱,流速2mL·min-1。收集洗脱液,减压浓缩至干,得棕褐色总缬草三酯提取物,以缬草三酯计含量达到51%(出膏率为26%)。取适量蜘蛛香药材,以料液比1∶20用60%乙醇浸泡药材6h后,于35℃超声提取(30min×3)。用HPD-600树脂装柱,上样浓度3.03mg·mL-1,上样容量24.24mg·g-1,先用0.1mol·L-1HCl的10%乙醇溶液洗脱除杂,直至洗液颜色不再变浅、固形物含量不再增加,后用0.1mol·L-1HCl的80%乙醇溶液,洗脱5BV,流速1mL·min-1,收集洗脱液,减压浓缩至干,得黄褐色总黄酮提取物,以橙皮苷计,含量达55%(出膏率为39%)。1.2.4大鼠肠蠕动测试1.2.5影响粘土娃娃的离开1.2.7影响大鼠的明黑匣子行为2两种评价手段的确立热板法和醋酸扭体镇痛实验是研究镇痛效应的经典方法;炭末法和家兔离体肠肌用于探讨对胃肠运动影响的实验,反应灵敏、操作简单;高架十字迷宫是筛选抗焦虑药物常用的非条件反射模型,明、暗箱是用于筛选抗焦虑药的一种简单易行的方法。文中针对每种药理学实验选取两种评价手段,这对合理、科学地评价其药理学反应具有重要意义。研究显示:蜘蛛香具有镇痛药效的主要成分是黄酮类,具有中枢神经抑制、抗焦虑药效的主要成分是缬草三酯类,据此推测也有可能是两种组分一定比例的组分复合物,但具体的活性成分或组分还有待研究。1.2.2黄酮对小鼠热行为的影响筛选痛阈值合格的小鼠,取♀小鼠于给药前先用RB-200型智能热板仪于55±0.5℃分别测定每只小鼠的正常痛阈值[将小鼠放于智能热板仪上至出现舔后足的所需时间作为痛阈值(s),连续2次,间隔30s,测定平均值即为正常痛阈值]。将舔后足时间<5s或>30s,或跳跃者不用于此实验。将痛阈值筛选合格的80只♀小鼠,根据其给药前正常痛阈值随机搭配均分为空白组(等体积纯净水)、蜘蛛香总黄酮和缬草三酯提取物组(浓度为0.01g·mL-1,高、中、低剂量为0.4、0.2、0.1g·kg-1,分别相当于生药量的1.54、0.77、0.38g·kg-1)、对照组[元胡止痛片2g·kg-1(0.05g·mL-1)];各受试药物均配制成溶液,ig给药。将痛阈值筛选合格的各组小鼠ig给药,连续6d,末次给药后1、2h时再分别用RB-200型智能热板仪测定各小鼠的痛阈值(痛阈值至60s,则停止实验取出小鼠,该小鼠的痛阈值以60s计算),于给药后30、60、120min分别测小鼠的痛阈值。结果显示:与空白组相比,在给药30min后蜘蛛香黄酮提取物的中、高剂量能显著提高小鼠痛阈值(P<0.01)。在给药后60min及120min时低剂量对提高小鼠痛阈值具有一定作用(P<0.05),总黄酮中、高剂量及元胡止痛片均能显著提高小鼠的痛阈值(P<0.01);在给药后30min,缬草三酯中、高剂量对小鼠的热刺激致痛显示出一定抑制作用(P<0.05),在给药后60min及120min时高剂量对小鼠热刺激致痛显示出显著抑制作用(P<0.01);与对照组相比,黄酮低剂量组在给药60min和120min时对提高小鼠痛阈值具有一定作用(P<0.05),总黄酮中、高剂量组均能显著提高小鼠的痛阈值(P<0.01)。缬草三酯各剂量对小鼠的热刺激致痛抑制作用不显著(P>0.05)(表1)。1.2.3不同剂量草三酯提取物对小鼠肝胰腺功能的影响取80只小鼠,♀♂兼用,分组与剂量同“1.2.2”项下方法。ig给药各组小鼠后1h,对每只小鼠ip0.2mL0.7%冰醋酸溶液,并立即观察记录小鼠发生扭体反应和在20min内出现扭体反应的次数。结果显示:与空白组比较,蜘蛛香总黄酮提取物中、高剂量及元胡止痛片均能显著延长扭体反应潜伏期和减少醋酸所引起的小鼠扭体次数(P<0.01);缬草三酯提取物中、高剂量对延长扭体反应的潜伏期和减少醋酸所引起的小鼠扭体次数具有一定作用(P<0.05)。与对照组比较,蜘蛛香总黄酮提取物高剂量能显著延长扭体反应的潜伏期和减少醋酸所引起的小鼠扭体次数(P<0.01),缬草三酯提取物各剂量对延长扭体反应的潜伏期和减少醋酸所引起的小鼠扭体次数作用不显著(P>0.05)(表1)。取80只小鼠,均分为空白组(等体积生理盐水)、蜘蛛香总黄酮和缬草三酯提取物高、中、低剂量组、对照组(香砂平胃颗粒20g·kg－1,浓度为1g·mL－1)。连续ig9d,每天1次。末次给药加6%的炭末,给药后10min脱颈处死小鼠,分离肠系膜,剪取上端至幽门、下端至回盲部的肠管,将小肠轻轻摆成直线,分别测量其全长和炭末推进长度。炭末推进率=炭末在肠内推进距离(cm)/小肠全长(cm)×100%。结果显示:与空白组比较,蜘蛛香总黄酮和缬草三酯提取物各剂量及香砂平胃颗粒均能显著增加小肠炭末推进率(P<0.01);与对照组比较,黄酮提取物中、高剂量和缬草三酯提取物高剂量能显著增加小肠炭末的推进率(P<0.01)(表2)。处死家兔后立即解剖,将肠管放入常温的台氏液中清洗,排尽肠的内容物。每组5只兔子共10个肠肌标本进行实验。空白组(等体积生理盐水);蜘蛛香总黄酮提取物高剂量组(0.4g·kg-1);缬草三酯提取物高剂量组(0.4g·kg-1);对照组(香砂平胃颗粒20g·kg-1)。每次取长约1.5~2.0cm的肠管,一端固定在麦氏浴管上,另一端连接在张力换能器上,恒温37℃,通空气,每分钟40~60个气泡,负荷张力约1~2g。记录肠管的收缩活动。待肠管收缩活动稳定后,描记一段正常收缩曲线。向浴槽内加入受试药液,观察药物的作用,描记曲线。结果显示:与空白组比较,蜘蛛香总黄酮提取物高剂量及香砂平胃颗粒对离体肠肌均有显著的舒张作用(P<0.01),缬草三酯提取物高剂量对离体肠肌具有一定的舒张作用(P<0.05)。与对照组比较,黄酮提取物高剂量对离体肠肌均有显著的舒张作用(P<0.01),缬草三酯高剂量对离体肠肌具有一定的舒张作用(P<0.05)(表3)。1.2.6总草三酯提取物对小鼠高架探索将80只小鼠随机均分成空白组(等体积生理盐水)、蜘蛛香总黄酮和缬草三酯提取物剂量组(按“1.2.1”项下剂量)、对照组(地西泮2mg·kg-1)。各组连续ig给药或生理盐水10d,第10d,给药组给药1h后,对照组给药0.5h后进行行为测试。将小鼠单独放入动物盒中,自由活动5min,测试时将小鼠置于高架十字迷宫中央区,分别记录5min内小鼠进入开臂次数和停留时间、进入闭臂次数和停留时间。以进入开臂次数与进入各臂总次数的百分比(OE)、在开臂内的活动时间与进入各臂的总活动时间的百分比(OT)作为抗焦虑作用的考察指标。结果显示:与空白组比较,蜘蛛香总缬草三酯提取物低、中、高剂量及地西泮均可明显增加小鼠OT和OE值(P<0.01),而总黄酮提取物对小鼠高架十字迷宫行为的影响不显著(P>0.05);与对照组比较,蜘蛛香总缬草三酯提取物高剂量能显著增加小鼠OT和OE值(P<0.01),提示缬草三酯类成分是关联抗焦虑药效的有效成分(表4)。分组及药物剂量同“1.2.6”项,测试时将小鼠置于明暗箱的明箱中央,头朝暗箱,释放后记录下5min内小鼠的穿箱次数及在明箱中活动的时间。结果显示: